基于药效成分比较研究山萸肉酒制前后分别配伍入六味地黄汤对绝经后骨质疏松症模型大鼠的干预作用＊

文 枝，于 慧，龙 琼，谭佳颖，黄 莉，肖望重，戴 冰＊＊

（1.湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007；2.祁阳市中医医院 永州 426100）

绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）为骨质疏松症中最为常见的一种，主要病因是由女性绝经后导致的雌激素水平下降[1-2]，一般发生在女性绝经后5-10 年。研究表明，女性绝经3 年内骨量下降速度明显加快[3]，对绝经后骨量减少妇女进行早期干预，减缓骨量丢失，可有效延缓骨质疏松的发生发展，对于防治PMOP 意义重大，这与中医历来重视“治未病”思想不谋而合。

PMOP 归属为中医“骨痿”的范畴，女子七七，任脉虚，肾精不足，是以骨髓生化乏源，骨骼失养，易发骨痿，即PMOP[4-5]。其主要病因为肾虚精亏，治法当以补肾益精为主。六味地黄汤为补肾益精经典方，其中的山萸肉为六味地黄汤之臣药，2020 版《中国药典》以其酒制品即酒萸肉入该方（简称六（酒）），但为何从其众多炮制品中从选择酒萸肉缺少实验依据。本课题组前期研究发现[6-7]，该方对PMOP 模型大鼠骨亚健康状态的早期干预作用可延缓PMOP 发生发展，（六酒）术后90 天对骨密度（Bone mineral density，BMD）对骨密度的改善作用优于六（山）；但其机理是否与其药效成分有关？仍有待进一步研究。

因此，本实验拟建立双波长HPLC 法、比较研究山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤中药效成分含量差异；同时，去卵巢法制备PMOP 大鼠模型，观察POMP模型大鼠术后90天血清雌激素（E2）、钙（Ca）、磷（P）、骨密度（BMD）值，脏器指数，体质量和骨组织微结构影响，探究山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤干预PMOP模型大鼠作用及其药效物质基础差异，为2020版药典选用酒萸肉配伍入六味地黄丸提供一定实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

6-8 月龄未孕雌性SD 大鼠（SPF 级）25 只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-004，分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心。本实验由湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准，符合实验动物伦理委员会指导原则。

1.2 试药及仪器

山萸肉，熟地，山药，丹皮，泽泻，茯苓（以上饮片均购于湖南春可回中药饮片有限公司，由湖南中医药大学第一附属医院张裕民教授鉴定），酒萸肉自制（取山萸肉饮片：黄酒=100 kg:30 kg 拌匀，闷润30 min 后，置于蒸具内隔水蒸360 min，取出，室温干燥即可得紫黑色或黑色酒萸肉饮片。）；莫诺苷标准对照品（批号：11640-201808，中国食品药品检定研究院）；马钱苷标准对照品（批号：111998-201703，中国食品药品检定研究院）；獐牙菜苷标准对照品（批号：DST200310-014，成都普思生物科技股份有限公司）；芍药苷标准对照品（批号：110736-201943，中国食品药品检定研究院）；5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）标准对照品（批号：DST191211-056，成都普思生物科技股份有限公司）；丹皮酚标准对照品（批号：110708-201908，中国食品药品检定研究院）；没食子酸标准对照品（批号：DST200710-008，成都普思生物科技股份有限公司）；阿仑膦酸钠片（云南万裕药业有限公司，国药准字号：J20130085）；E2诊断试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法，雅培爱尔兰诊断公司，批号：H10192R01）等；

Agilent 1260 infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（G7111A 四元泵、G7117C DAD 检测器、G7129A 自动进样器、美国安捷伦公司）；电子分析天平（日本SHIMADZU 公司）；双能X 线骨密度仪（意大利LACN）；光学显微镜（日本Olympus）；石蜡切片机（中国Thermo Secientific公司）等。

2 方法

2.1 六（山）、六（酒）中药效成分含量测定

2.1.1 色谱条件

流动相：乙腈（B）-0.3%磷酸（D）梯度洗脱（0-7 min，0%→8% B；7-15 min，8%→10% B；15-20 min，10%→15% B；20→30 min，15%→23% B；30→50 min，23%→45% B），流速0.6 mL·min-1，柱温30℃，进样量20 μL，检测波长：240 nm（莫诺苷，马钱苷，獐芽菜苷，芍药苷），274 nm（没食子酸，5-HMF，丹皮酚），溶剂空白液对图谱无干扰，供试品各溶液色谱图中，各峰分离度均大于1.5，色谱条件适应性良好。

2.1.2 溶液制备

（1）供试品溶液的制备：分别取六（山），六（酒）粉末（熟地：山萸肉：山药：丹皮：泽泻：茯苓=8∶4∶4∶3∶3∶3，下同）2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密移取25 mL 50%甲醇溶液，称重，超声提取40 min 后冷却，再次称重，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm 滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

（2）对照品溶液的配制：分别精密称定莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-HMF、丹皮酚对照品适量，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容成 质 量 浓 度 分 别 为0.7152、0.6495、0.531、0.6852、0.5092、0.6508、0.8270 mg·mL-1的对照品母液，置于4℃冰箱备用。分别精密吸取上述母液1.2 mL，置于10 mL容量瓶中，定容，即得混合对照品溶液。质量浓度分别为61.1、78.1、57.2、31.2、63.7、54.8、99.2 μg·mL-1。

2.1.3 方法学考察

（1）线性关系考察：精密移取莫诺苷，马钱苷，獐芽菜苷及芍药苷对照品母液各0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别置于同一10 mL溶液瓶中；精密移取没食子酸，5-HMF 及丹皮酚对照品母液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别置于另一10 mL溶液瓶，加50%甲醇稀释至刻度，得不同浓度梯度混合对照品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样。以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X，μg·mL-1）为横坐标进行线性回归。没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、丹皮酚的线性方程分别为y=103.94x+70.33(R=0.9996)、y=179.88x+98.76 (R=0.9995)、y=51.46x+8.04(R=0.9993)、y=49.04x-1.08(R=0.9990)、y=41.60x+1.32(R=0.9990)、y=30.68x+4.06(R=0.9999)、y=133.19x+85.36(R=0.9993)。结果表明，没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、丹皮酚在测定浓度范围内线性关系良好。

（2）精密度考察：精密移取莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-HMF、丹皮酚混合对照品溶液，相同色谱条件测定，进样量20l，平行测定6 次，测定峰面积，得RSD 分别为1.35%、1.71%、1.38%、2.00%、0.68%、1.36%、1.24%，可知RSD≤2.00%，表明此仪器精密度较好。

（3）稳定性考察：同一份供试品溶液，分别放置0、2、4、6、8、24 h，相同色谱条件分别进样，测定莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-HMF、丹皮酚峰面积，得RSD 分别为1.06%、1.27%、1.45%、1.17%、1.62%、1.42%、1.41%，可知RSD≤2.00%，表明供试品放置24 h内基本稳定。

（4）重复性实验：取同一份六味地黄汤样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件分别进样，测定莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-HMF、丹皮酚峰面积，计算其含量，得各成分含量RSD 分别为1.57%、1.38%、0.48%、0.34%、0.52%、1.58%、0.33%，可知RSD≤2.00%，表明本方法重复性较好。

（5）加样回收率实验：取已知莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-HMF、丹皮酚含量的六味地黄汤样品粉末1 g，精密称定，平行称取6 份，每份加入等量混合对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件分别进样，测定峰面积，并计算平均回收率与RSD 值，结果见表1，表明该方法准确度较高。

表1 六味地黄汤中七种药效成分平均回收率及RSD

表2 六（山）及六（酒）中7种有效成分含量（±s，n=6）

表2 六（山）及六（酒）中7种有效成分含量（±s，n=6）

注：方差分析，与六（山）组比较，fP＜0.05。

7种成分总量（mg·g-1）5.77±0.09 6.13±0.06f组别六（山）六（酒）莫诺苷1.72±0.03 1.54±0.02f马钱苷（mg·g-1）1.13±0.01 1.13±0.01獐牙菜苷（mg·g-1）0.10±0.01 0.11±0.01芍药苷（mg·g-1）0.96±0.02 0.97±0.02没食子酸（mg·g-1）0.45±0.01 0.64±0.03f 5-HMF（mg·g-1）0.05±0.01 0.36±0.01f丹皮酚（mg·g-1）1.37±0.01 1.38±0.01

2.1.4 六（山）、六（酒）中七种药效成分含量测定

分别取六（山）及六（酒）供试品粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件分别进样，平行进样6次，分别得六（山），六（酒）HPLC图谱及各药效成分的峰面积，记录并分别计算六（山），六（酒）中七种药效成分含量。

2.2 动物实验

2.2.1 药液制备

六味地黄汤（熟地黄24 g、山萸肉（酒或生）12 g、山药12 g、牡丹皮9 g、泽泻9 g、茯苓9 g），6 倍量水浸泡30 min 后武火煮沸，后文火再煎30 min，趁热过滤，重复煎煮两次，合并滤液后用旋转蒸发仪浓缩，得生药浓度为1.125 g·mL-1药液，4℃冰箱保存备用。

2.2.2 分组

所有大鼠编号、称重后采用随机数字表法将大鼠随机分为5组，每组大鼠5只，即假手术组（K组），模型组（M 组），阳性药物阿仑膦酸钠片组（Y 组），六（山）组（LS组）和六（酒）组（LJ组）。

2.2.3 造模

适应性喂养1周后，行去卵巢术，禁食不禁水24 h，腹腔注射1%的戊巴比妥钠；麻醉成功后，大鼠俯卧位固定，脱毛并消毒后，于双侧肋后缘切纵形切口，顺Y形子宫一侧向远端探查，找到梅花状的卵巢后摘除，止血后还纳入腹腔，另一侧操作同（注：假手术组暴露卵巢后，取邻近卵巢大小的脂肪组织切除）。术后肌注10万单位青霉素钾以预防感染，连续3天。术后24 h，大鼠恢复正常饮食。

2.2.4 给药

造模手术完成后，于术后第5天开始灌胃给药。Y组（6.3 mg·kg-1），LS组（6.75 g·kg-1）和LJ组（6.75 g·kg-1）分别灌胃给药相应的剂量药物，K 组、M 组大鼠给予等体积水灌胃（煎药用水）。每日1 次，给药后每周称量体质量1次，并根据各组大鼠体质量调整给药量，持续给药90天。

2.2.5 标本采集

5 个实验组分别于术后90 天取大鼠5 只，禁食不禁饮24 h，称重后以4%戊巴比妥钠麻醉，用碘伏消毒手术部位，脱毛开腹，腹主动脉采血后，取大鼠子宫、心、肝、脾以及双肾称重，并剥离大鼠两侧股骨（保留骨膜）。血液静置2 h 后，以3500 r·min-1离心15 min，移液枪移取上层澄清血清并置于-80℃保存；取每只大鼠右侧股骨头，4%多聚甲醛固定48 h，用于HE 染色，左侧股骨与剩余右侧股骨置于-80℃冰箱保存备用。

2.2.6 指标检测

（1）PMOP 模型大鼠骨组织HE 染色：取“2.2.5”项下4%多聚甲醛固定股骨头，10% EDTA 慢脱脱钙液对骨组织脱钙处理，每5 天换1 次脱钙液，至骨组织变软针刺可入且无阻力感则表示脱钙完成。脱钙完全后取出股骨头，PBS冲洗后进行骨组织脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋，切片（厚度：2-4 mm），HE 染色，光镜下观察股骨头形态改变。

（2）PMOP 模型大鼠的血钙、磷以及血清E2 测定：使用全自动生化仪检测模型大鼠血清中的Ca、P水平，采用化学发光免疫分析法检测血清中的E2。

（3）PMOP 模型大鼠BMD 值测定：从-80℃冰箱取模型大鼠左侧股骨，除去肌肉、筋膜等并用纱布包裹置于离心管中，由湖南中医药大学第一附属医院骨密度室进行测量。

（4）PMOP 模型大鼠的脏器指数以及体质量测定：每周测:1 次大鼠体质量，记录体质量变化。除去模型大鼠心、肝、脾、双肾以及子宫的脂肪组织，称重。脏器指数=模型大鼠器官（子宫、心、脾、肝、肾）重量（g）/模型大鼠处死前体质量（g）×100%

2.2.7 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计软件进行统计分析，所有数据用均值±标准差（±s）表示，PMOP 模型大鼠体重数据为多时点重复测量分析，采用两因素重复测量方差分析法；六味地黄汤中七种药效成分含量和PMOP模型大鼠血清中E2、血磷、血钙水平、骨密度及子宫指数，数据进行正态性、方差齐性检测，满足采用单因素方差分析法，组间比较采用LSD-t检验。不满足则用非参数检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。实验过程中，由于术后感染、实验操作不当等原因，部分组大鼠出现死亡现象，除去离群值后，每组大鼠计4 只。

3 结果

3.1 六（山），六（酒）中七种药效成分含量测定

可知，六（山）、六（酒）中均含有莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-HMF、丹皮酚7种有效成分，且六（酒）中七种有效成分的总含量高于六（山）（P＜0.01），其中，六（酒）没食子酸、5-HMF 含量较六（山）高，而莫诺苷含量较六（山）低（P＜0.01）见图1。

图1 混合对照品（A）、山萸肉入方的六味地黄汤（B）酒萸肉入方的六味地黄汤（C）、HPLC图谱

3.2 PMOP大鼠模型的评价

术后90天，与K组比较，M组大鼠的BMD值，以及血清中E2、Ca、P 水平较低（P＜0.01），结果见表3-4；骨组织结构不完整，骨小梁排列稀疏，部分骨小梁断裂，骨髓腔内可见大量脂肪细胞，见图2，提示造模成功。

图2 HE染色观察六味地黄汤对PMOP模型大鼠术后90天股骨微结构变化（x100）

表3 六味地黄汤对PMOP模型大鼠术后90天血清中E2、BMD的影响（±s，n=4）

表3 六味地黄汤对PMOP模型大鼠术后90天血清中E2、BMD的影响（±s，n=4）

注：方差分析，与K组比，dP＜0.05；与M组比，eP＜0.05；与LS组比，fP＜0.05。

BMD（g·cm-2）0.29±0.01 0.18±0.02d 0.23±0.01de 0.23±0.02de 0.26±0.02def组别K组M组Y组LS组LJ组剂量--6.3 mg·kg -1 6.75 g·kg -1 6.75 g·kg -1 E2（pg·mL-1）11.6±1.14 5.50±1.29d 9.00±1.39e 7.50±1.29de 9.25±0.96def

3.3 六味地黄汤对PMOP 模型大鼠术后90 天股骨微结构的影响

光镜下观察可知，术后90 天，脂肪细胞明显增多且骨小梁数量减少，间隙增大，骨微结构恶化最为严重。与模型组比较，LS，LJ 组脂肪空泡较少见，或骨小梁排列较为整齐，间隙变大和断裂情况较少，但六（山）、六（酒）组无明显区别。

3.4 六味地黄汤对PMOP 模型大鼠术后90 天血清中的E2水平、BMD的影响

与M 组比较，术后90 天，LS 组及LJ 组E2 水平、BMD 值明显升高（P＜0.01)，且LJ 组＞LS 组（P＜0.05），结果见表3。提示六味地黄汤可有效升高PMOP 模型大鼠血清E2 水平、有效减少大鼠去卵巢后的骨量丢失，升高PMOP模型大鼠BMD值，LJ疗效优于LS。

3.5 六味地黄汤对PMOP 模型大鼠术后90 天的Ca、P水平的影响

与M 组比较，术后90 天，LS 及LJ 组PMOP 模型大鼠血清Ca、P 水平均明显升高（P＜0.05，P＜0.01），结果见表4。提示六味地黄汤可有效升高PMOP 模型大鼠血清Ca、P水平。

表4 六味地黄汤对PMOP模型大鼠术后90天的血清中Ca、p水平的影响（±s，n=4）

表4 六味地黄汤对PMOP模型大鼠术后90天的血清中Ca、p水平的影响（±s，n=4）

注：方差分析，与K组比，dP＜0.05；与M组比，eP＜0.05；与LS组比，fP＜0.05。

血磷（mmol·L-1）1.21±0.02 0.91±0.03d 1.22±0.01de 1.26±0.01de 1.25±0.02de组别K组M组Y组LS组LJ组剂量--6.3 mg·kg -1 6.75 g·kg -1 6.75 g·kg -1血钙（mmol·L-1）2.08±0.04 1.82±0.05d 2.07±0.05e 2.01±0.04de 2.05±0.02de

表5 六味地黄汤对PMOP模型大鼠术后90天的子宫指数影响（-x s，n=4）

3.6 六味地黄汤对PMOP 模型大鼠术后90 天的脏器指数的影响

术后90 天，LS 及LJ 组大鼠子宫指数均高于M 组（P＜0.05），LJ 组大鼠肝，脾指数高于M 组（P＜0.05）；但LS、LJ组大鼠的心、肾指数变化无统计学意义；结果见图3、表2。提示去卵巢术对大鼠子宫的形态和功能的影响较大，六味地黄汤可延缓PMOP 模型大鼠雌激素缺乏引起的子宫萎缩，改善其肝、脾功能。

图3 六味地黄汤干预对术后90天模型大鼠子宫形态影响

3.7 六味地黄汤对PMOP 模型大鼠术后90 天的体质量影响

采用两因素重复测量的方差分析法研究六味地黄汤对大鼠体质量的影响，由图4可知，随着术后时间的延长，除空白组外，各组大鼠体质量均呈上升趋势，且以模型组最为明显；但六味地黄汤对PMOP 模型大鼠的体质量影响无显著性差异。

图4 六味地黄汤对PMOP模型大鼠体质量的影响

4 讨论

目前研究表明，山萸肉主含有机酸，环烯醚萜苷及苷元、多糖等成分[8-10]，其中没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷均有一定的抗骨质疏松作用，可能与没食子酸可明显增强成骨细胞碱性磷酸酶活性，促进成骨细胞增殖分化有关[11]；5-HMF 可刺激矿化结节的形成，促进成骨细胞增殖分化[12-13]，莫诺苷可减轻骨丢失并改善骨微结构[14]，莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷均明显表现出对大鼠成骨细胞的促增殖作用[15-18]有关；但其炮制后配方入六味地黄丸后对上述成分影响较大[19-20]。六味地黄汤中丹皮的主要药效成分之一的丹皮酚可激活Wnt2/β-catenin 通路，增加去卵巢大鼠椎骨骨密度，减轻PMOP[21]；Tsai 等[22]发现丹皮酚抑制破骨细胞分化因子诱导的破骨细胞生成、抑制骨吸收；杨立宇等[23]研究发现芍药苷能通过上调成骨分化基因，促进成骨分化，改善骨质疏松模型小鼠的骨微结构，从而发挥抗骨质疏松作用。可见，山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤中均含有上述7 种药效成分，且均与骨质疏松症及其机理相关。

本研究发现，山萸肉酒制前后配伍入方六味地黄汤后均含有莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-HMF 以及丹皮酚7 种药效成分，可在绝经早期即可有效干预PMOP，从而延缓PMOP 发生发展；且酒萸肉入方的六味地黄汤抗骨质疏松作用优于山萸肉入方的六味地黄汤，其机制可能与六（酒）中7 种有效成分的总含量高于六（山），该7种成分与成骨细胞、破骨细胞增殖分化密切相关，从而可调节骨代谢失调、提高骨密度、改善PMOP 有关。可为2020 版药典六味地黄丸选用酒萸肉入方及临床上应用六味地黄汤防治PMOP提供一定的实验依据。