欧前胡素调节ERK/MAPK信号通路对肺结核大鼠炎症反应的影响*

陈杨君 陆霓虹 刘洪璐 杨艳 刘梅艳

(昆明市第三人民医院呼吸与危重症医学科,云南 昆明 650041)

肺结核是全球十大传染病死亡原因之一,其致死率极高,还可能引发与持续炎症和组织损伤等相关疾病,其主要症状以低热胸闷、乏力、咳嗽为主,对患者的生活造成极大的影响[1-2]。结核分歧杆菌是最具破坏性的传染病病原体之一,它可逃避或调节宿主的免疫反应,引发大量炎症反应,导致严重肺损伤,因此抑制炎症反应可有效治疗肺结核病[3]。欧前胡素(Imperatorin,Imp)是一种天然存在的呋喃香豆素,存在于伞形科蔬菜、柑橘类水果和白芷、当归等一些草药中,已被证明其具有多种药理活性,如抗氧化、镇痛、抗癌、抗炎和舒张血管等,但其在肺结核疾病中的研究鲜有报道[4]。细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)介导的有丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路被认为是经典的MAPK信号转导通路,细胞外信号刺激或细胞内通路转导分子异常,可能会导致ERK/MAPK信号通路过度激活,从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡及分化,参与疾病的发生发展[5]。如在结核病患者血清中MAPK信号通路被激活,该通路可能在免疫反应中起关键作用[6]。但Imp是否能通过ERK/MAPK信号通路参与抑制肺结核疾病中炎症反应报道鲜少,因此本实验旨在探索Imp通过调节ERK/MAPK信号通路对肺结核大鼠炎症反应的影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠64只,体重200～230 g,购自深圳灵赋拓普生物科技有限公司(许可证号：SYXK(粤)2022-0293)。大鼠均在无特定病原体的环境(22～25 ℃,40%～50%湿度,12 h光照和黑暗循环)中饲养,可随意进食和饮水。该研究已获得医院动物伦理委员会的批准。

1.1.2 实验试剂与仪器 Imp购自上海源叶生物科技有限公司;鼠源表皮生长因子(EGF)购自美国Accurate Chemical公司;结核杆菌(H37RV)购自美国ATCC公司;白细胞介素-6(IL-6)试剂盒、γ干扰素(IFN-γ)试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色液、环氧化酶-2(COX-2)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;RIPA裂解缓冲液购自碧云天科技有限公司;Tunel凋亡试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;增强的化学发光试剂盒购自BioVision公司;p-ERK1/2、ERK1/2、p38 MAPK一抗购自Abcam公司。酶标仪(PT-3502G)购自普天新桥技术有限公司;全自动菌落计数仪(ZX-400)购自泽析生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺结核模型的制备及干预 大鼠适应性喂养一周后,随机分为造模组52只及对照组12只,造模组大鼠分别经尾静脉注射体积为2 mL,剂量5 mg/mL结核杆菌[7],对照组尾静脉给予等体积的生理盐水处理。各组随机选取两只大鼠,病理组织切片显示液化灶、干酪样坏死等病变为造模成功[8]。随后将造模组50只大鼠随机分为模型组、Imp低(Imp-L)、中(Imp-M)、高剂量(Imp-H)组、Imp-H+ERK特异性激活剂(EGF)组,每组10只。造模成功后,Imp-L组、Imp-M组、Imp-H组分别给予25、50、100 mg/kg Imp灌胃干预[9];Imp-H+EGF组在100 mg/kg Imp灌胃基础上,腹腔注射25 mg/kg EGF干预[10],其余组以生理盐水干预,连续给药12周(1天/次)。

1.2.2 样本采集 给药12周后,大鼠腹腔主动脉采集血液,用于ELISA检测;通过腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉并处死大鼠,分离左肺组织,固定在福尔马林中,用于HE及Tunel染色;分离右肺组织储存于-80℃冰箱中,用于Western blot检测及统计结核杆菌菌落数。

1.2.3 ELISA检测各组血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平 收集血液上清液,使用试剂盒测定血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平,实验结果为3个重复样品的平均值,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 统计大鼠肺组织中结核杆菌菌落数 收集部分右肺组织,加入0.9%的生理盐水、硫酸制备细胞悬液及消化细胞,室温下接种到培养基上,孵育5周后,对结核杆菌菌落数进行计数。

1.2.5 HE检测大鼠肺组织病理学变化 将固定的肺组织样本脱水、包埋在石蜡中并切片。用二甲苯脱蜡后,在室温下使用一系列梯度浓度的乙醇(100%乙醇5 min、95%乙醇1 min、80%乙醇5 min、75%乙醇5 min和蒸馏水2 min)脱水处理。然后在室温下用苏木精和伊红染色12 min。用光学显微镜观察切片中病理变化。

1.2.6 Tunel染色检测细胞凋亡 将固定的肺组织常规切片,依次加入蛋白酶K、Tunel反应液、coverter-POD,DAB显色后,苏木精复染、脱水、透明后,封片,随机选取5个视野,计算细胞凋亡率(其中凋亡细胞为棕褐色)。

1.2.7 Western blot检测通路相关蛋白表达 取肺组织,加入RIPA 裂解缓冲液在4℃下离心3000 g,15 min以收集上清液。使用BCA蛋白质测定试剂盒对总蛋白质进行定量。使用10% SDS-PAGE分离蛋白质,随后在4℃下转移到PVDF膜。PVDF膜在室温下用含Tris缓冲盐的5%脱脂牛奶封闭60 min。将膜与以下抗体一起孵育：p-ERK1/2(稀释度1∶1 000)、ERK1/2(稀释度1∶1 000)、p38 MAPK(稀释度1∶1 000)在4℃下过夜。随后与辣根过氧化物酶偶联的二抗(稀释度1∶5 000)在37℃下孵育1 h。反应条带通过增强的化学发光试剂盒可视化,以GAPDH为内参,Image J 2.1软件分析结果。

2 结果

2.1 Imp对各组大鼠血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平的影响 与对照组相比,模型组IFN-γ、IL-6、COX-2水平显著增加(P<0.05);与模型组相比,Imp-L组、Imp-M组、Imp-H组IFN-γ、IL-6、COX-2水平显著降低,以Imp-H组变化最为显著(P<0.05);与Imp-H组相比,Imp-H+EGF组IFN-γ、IL-6、COX-2水平显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平的比较

2.2 Imp对各组大鼠肺组织中结核杆菌菌落数的影响 与对照组相比,模型组结核杆菌菌落数显著增加(P<0.05);与模型组相比,Imp-L组、Imp-M组、Imp-H组结核杆菌菌落数显著降低,以Imp-H组变化最为显著(P<0.05);与Imp-H组相比,Imp-H+EGF组结核杆菌菌落数显著增加(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠肺组织中结核杆菌菌落数的比较

2.3 Imp对各组大鼠肺组织病理学的影响 对照组无明显病理发生;模型组肺组织炎性浸润严重,出现大量增生型结核结节,肺泡腔增大;Imp-L组、Imp-M组、Imp-H组病理损伤得到改善,炎性浸润逐渐缓解,其中Imp-H组接近于对照组;Imp-H+EGF组肺组织炎性浸润进一步加重,病理损伤较为严重。见图1。

图1 肺组织病理学变化(HE,200×)

2.4 Imp对各组大鼠细胞凋亡的影响 与对照组相比,模型组细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与模型组相比,Imp-L组、Imp-M组、Imp-H组细胞凋亡率显著降低,以Imp-H组变化最为显著(P<0.05);与Imp-H组相比,Imp-H+EGF组细胞凋亡率显著增加(P<0.05),见图2、表3。

图2 细胞凋亡变化(200×)

表3 各组大鼠细胞凋亡的比较

2.5 Imp对各组大鼠肺组织p-ERK1/2、ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达水平的影响 与对照组相比,模型组p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK显著增加(P<0.05);与模型组相比,Imp-L组、Imp-M组、Imp-H组p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK显著降低,以Imp-H组变化最为显著(P<0.05);与Imp-H组相比,Imp-H+EGF组p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK显著增加(P<0.05),见图3、表4。

图3 肺组织中p-ERK、ERK、p38 MAPK蛋白表达

表4 肺组织中p-ERK1/2、ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达比较

3 讨论

肺结核是由分枝杆菌菌株引起的,其中结核分枝杆菌主要在人体中观察到,世界卫生组织数据显示,全球有1000万新发肺结核病例和150万人死亡[11]。目前治疗肺结核主要有异烟肼、利福平等药物,但由于其对肝等器官造成损伤,使患者依从性降低,有效治疗对于控制肺结核的传播和降低其死亡率具有重要意义[8,12]。因此,本研究以结核分枝杆菌建立肺结核大鼠模型,通过分析肺结核大鼠炎症相关指标,探索药物的作用效果及机制。

Imp是呋喃香豆素的衍生物,以白色细长针状或结晶状存在,广泛存在于多种中草药中,具有多种药理学特性包括抗癌、抗炎、抗氧化、神经保护和免疫调节作用[13]。Hsieh等[14]研究发现,Imp可通过抑制小鼠T辅助细胞(Th)2反应改善屋尘螨诱导的过敏性哮喘。Li等[15]研究还发现,Imp具有抗炎作用,可改善肺部炎症、水肿和纤维化,可能是与炎症相关的肺病的潜在抗炎剂。结核分枝杆菌菌落数可反映肺结核的严重程度[16],本研究反映肺结核大鼠肺组织严重病变,大量炎性浸润及炎症因子IL-6、IFN-γ、COX-2产生,结核杆菌菌落数及细胞凋亡率明显增加,提示大鼠产生肺结核与炎性浸润有关。不同剂量的Imp干预后,肺组织病变逐渐减轻,菌落数、炎性因子水平及凋亡数逐渐降低,提示Imp可抑制血清中炎性因子的释放及肺组织中结核杆菌的增殖及细胞凋亡,改善结核杆菌造成的肺损伤,阻止炎性因子的进展。

MAPK信号通路包含ERK1/2、p38 MAPK,与调节炎症及细胞凋亡、细胞生长与分化等有关[17]。如缺氧会激活ERK/P38 MAPK信号通路,从而促进肺腺癌细胞的进展和转移,在癌症的发生和发展中起着关键作用[18]。如参苓白术散可干预溃疡性结肠炎大鼠水通道蛋白的表达,可能与抑制ERK/p38 MAPK信号通路激活有关[19]。HY1702通过抑制MAPK/ERK通路减少了脂多糖刺激的巨噬细胞的炎症和新生儿急性呼吸窘迫综合征症状[20]。沉默脂质运载蛋白2表达可通过抑制MAPK/ERK通路抑制急性呼吸窘迫综合征的炎症和氧化应激损伤[21]。本研究发现肺结核大鼠p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK表达上调,推测其发生发展与ERK/MAPK信号通路的激活有关。不同剂量的Imp干预后,p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK表达逐渐被抑制,而肺组织病理学得到改善,炎症反应被抑制,推测Imp可通过抑制ERK/MAPK信号通路的激活,阻止炎性反应。为验证该推测,实验以ERK激活剂-EGF进行回复验证,结果显示EGF逆转了Imp对肺结核大鼠肺损伤的保护作用,表明Imp的抗炎作用可能通过抑制ERK/MAPK信号通路实现。

4 结论

Imp可通过抑制ERK/MAPK信号通路的激活降低肺结核炎症反应,成为潜在的治疗肺结核药物,但由于通路复杂,尚需进一步核验。