芹菜素通过AMPK/mTOR通路调控肺癌A549细胞自噬*

雷轩 罗丹 卢梁杰 高露洋 王文军

(西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科,四川 泸州 646000)

我国肺癌的发病率及死亡率均为恶性肿瘤之首,是癌症相关死亡的重要原因[1-2]。目前肺癌主要以综合治疗为主,但由于多数患者确诊时已为中晚期,丧失手术机会,加之化疗药物毒副作用大,耐药性严重,肺癌的预后仍不尽如人意[3-4],因此迫切需要开发低毒、有效的新型抗肿瘤药物。近年来,在众多新型高效低毒的抗癌药物中,中医药受到越来越多的关注。芹菜素(Apigenin ,APG)是一种常见的天然植物黄酮类化合物,具有多种潜在药理活性,如抗炎、抑制氧化应激、抗肿瘤、诱导凋亡和自噬等[5-7]。已有研究证实芹菜素对肺癌A549细胞增殖、侵袭、迁移有显著抑制作用,并可促进凋亡[8-9],但芹菜素在肺癌A549细胞自噬过程中的作用及相关机制报道鲜少,因此本项工作拟探讨肺癌A549细胞自噬过程中芹菜素所产生的影响,并对其可能的作用机制进行分析,以期为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 肺癌A549细胞来源于西南医科大学中心实验室。芹菜素(规格：每支10 mg,纯度：>99%,货号：HY-N1201),腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制剂Compound C(规格：每支5 mg,纯度：>99%,货号：HY-13418A)均购自美国MCE公司;细胞计数试剂盒购自碧云天生物技术公司;细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)购自Beyotime;β-Actin抗体购自天德悦公司,P62抗体购自Abcam;微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体、p-AMPKα抗体、AMPKα抗体、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体、p-mTOR抗体均购自CST公司;胰酶-EDTA、PBS购自吉诺医药生物技术有限公司;RIPA总蛋白裂解液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、丽春红染液、ECL化学发光检测试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液、抗体洗脱液、显影定影液、脱脂奶粉等均购自ASPEN公司。

1.2 细胞培养及分组 在含10%FBS+1%P/S的F12K培养液中放置人肺癌A549细胞,置于5%CO2加湿培养箱中37 ℃下培养;等待细胞融合至80%时,吸出培养液,用PBS清洗细胞,去除上清,胰酶消化后加入培养液进行传代培养,收集培养后的细胞进行后续实验。将A549细胞分为空白对照组(0 μmol/L APG),低、中、高浓度组(20,40,80 μmol/L APG)和抑制剂组(80 μmol/L APG+10 μmol/L AMPK抑制剂Compound C)5组。

1.3 CCK-8法检测芹菜素对A549细胞增殖的影响 将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化后配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液,按10 000个/孔接种于96孔板,每孔加入100 μL,放入5%CO2培养箱中37℃下培养24 h。24 h后分别加入终浓度为0、20、40、80、160 μmol/L的芹菜素培养24、48、72 h,各组均设立6个复孔,加入CCK-8溶液继续孵育2 h。使用酶标仪测定各孔450 nm吸光度值(A值),以溶剂处理的细胞为对照组,按公式计算药物对细胞的增殖抑制率。抑制率%=(A值对照组-A值实验组)/(A值对照组-A值空白组)×100%。计算24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)值。

1.4 MDC染色法检测芹菜素对A549细胞自噬的影响 各组干预48 h后,根据细胞自噬染色法(MDC法)试剂盒使用说明进行染色,染色后使用荧光显微镜(×3000倍)对比观察,各组随机选取3个视野进行拍照并计数,检测到高亮点状荧光表示自噬小泡,参照文献[10]计算积分光密度值(IOD)。以上步骤重复3次。

1.5 Western blot检测自噬及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达水平 各组培养48 h后收集细胞,用PBS多次清洗细胞以去除培养液,加入RIPA裂解液裂解细胞,反复摇动培养瓶使细胞充分裂解,提取总蛋白,使用BCA试剂盒检测样品蛋白浓度;样品蛋白经电泳、转膜后,将膜移至封闭液孵育盒,室温下封闭1 h。除去残留封闭液,加入稀释好的一抗p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ及P62抗体4℃过夜。孵育结束后,用TBST洗涤3次;将稀释好的二抗加入,孵育30 min后摇床上TBST洗涤3次。化学发光法显影、拍照,以β-actin作为内参蛋白,使用AlphaEaseFC软件分析目标带的光密度值。以上步骤重复3次。

2 结果

2.1 芹菜素对A549细胞增殖的影响 空白对照组培养24、48、72 h的细胞增殖抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较,芹菜素处理后A549细胞增殖抑制率随浓度增加呈上升趋势,呈浓度依赖关系(P<0.05)。20、40、80 μmol/L芹菜素组随作用时间延长,对A549细胞的增殖抑制效应逐渐增加,呈时间依赖关系(P<0.05)。160 μmol/L芹菜素组培养48及72 h的细胞增殖抑制率明显高于24 h(P<0.05),但48与72 h之间的细胞增殖抑制率无统计学差异(P>0.05)。见表1、图1。经SPSS软件分析芹菜素作用A549细胞24、48、72 h的IC50值分别为128.13、52.18、24.03 μmol/L。

图1 芹菜素对A549细胞增殖抑制率的影响

表1 芹菜素对A549细胞增殖抑制率的影响

2.2 芹菜素对A549细胞自噬的影响 与空白对照组比较,低、中、高浓度组A549细胞中检测到具有高亮点状荧光的自噬小泡数量及IOD值逐渐增加,细胞自噬呈浓度依赖性增加(P<0.01)。抑制剂组与高浓度实验组比较,细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡及IOD值减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2、3。

图2 芹菜素对A549细胞自噬的影响(3000×)

图3 积分光密度值(IOD)比较

2.3 芹菜素对A549细胞中自噬相关蛋白表达的影响 低、中、高浓度组与空白对照组比较,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达水平依次升高,P62蛋白表达水平依次降低,均呈浓度依赖性(P<0.05)。抑制剂组与高浓度组比较,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达水平下降,而P62蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 芹菜素对A549细胞自噬相关蛋白表达的影响

2.4 芹菜素对A549细胞中AMPK/mTOR通路相关蛋白表达的影响 与空白对照组相比,各浓度芹菜素组p-AMPKα表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值随浓度升高依次增加,而p-mTOR表达水平及p-mTOR/mTOR比值随浓度升高依次降低,均呈浓度依赖性(均P<0.05)。与高浓度组比较,抑制剂组p-AMPKα蛋白表达水平和p-AMPKα/AMPKα比值下降,而p-mTOR蛋白表达和p-mTOR/mTOR比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 芹菜素对A549细胞AMPK/mTOR通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

芹菜素是一种广泛分布的天然植物类黄酮,具有多种生理功能及药理作用[11]。近来,芹菜素因其抗肿瘤活性和低毒性而被广泛研究[12]。已有研究表明,芹菜素以剂量依赖方式降低人黑色素瘤细胞A375P和A375SM的细胞活力[13]。在肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2中,芹菜素以剂量和时间依赖方式表现出显著抗增殖活性,而对非致瘤细胞系LO2的细胞活力无显著影响[14]。本研究结果显示,芹菜素呈浓度依赖性显著抑制肺癌A549细胞增殖活性,且在20、40、80μmol/L浓度下呈时间依赖性。

自噬是溶酶体介导的细胞自我消化过程,作为Ⅱ型程序性细胞死亡,对肿瘤的发生发展过程具有重要作用[15]。在自噬体形成过程中,自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)被脂质化,LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ,聚集于自噬体膜,蓄积的LC3Ⅱ被视为自噬标志物[16]。P62是一种多功能支架蛋白,参与各种信号通路的调节及自噬,作为一种重要的适配器,P62通过LIR结构域与核心自噬蛋白质LC3相互作用,介导特定的细胞器和蛋白质聚集体递送至自噬溶酶体后共同被降解,细胞内P62水平严格受自噬活性调控,其表达水平与自噬活性成反比[17-18]。研究显示,芹菜素可通过促进LC3蛋白的转化,p62降解及酸性囊泡细胞器的形成显著增加肝癌HepG2细胞、甲状腺乳头状癌BCPAP细胞中的自噬水平,诱导细胞自噬[19-20]。此外,芹菜素也能通过诱导胃癌AGS细胞、肺鳞癌NCI-H520细胞、结肠癌HCT116细胞自噬和凋亡,抑制肿瘤生长[21-23]。本研究显示,芹菜素处理A549细胞后,高亮点状荧光自噬小泡及自噬标志蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表达水平呈浓度依赖性增加,而P62蛋白表达水平逐渐降低,表明芹菜素可以促进肺癌A549细胞自噬。

AMPK是一种能量传感器,基本存在于所有真核生物中,由异源三聚体复合物组成,包括α催化亚基和β、γ调节亚基,在代谢紊乱和癌症中起着关键作用[24]。AMPK通路通过磷酸化而活化,活化的AMPK可调节各种代谢过程,包括自噬[25]。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是细胞代谢和自噬的重要调节因子,自噬诱导和mTORC1激活之间存在紧密的反向耦合关系[26]。AMPK/mTOR是细胞中从合成代谢到分解代谢的转换,是自噬调控的关键途径,通常充当自噬的起始途径[27]。已有研究证实,芹菜素可激活胃癌细胞中的AMPK通路,促进AMPK磷酸化,并下调p-mTOR来促进自噬性细胞死亡[28]。本研究结果显示,芹菜素可活化肺癌A549细胞中AMPK/mTOR通路,上调p-AMPKα蛋白表达,增加p-AMPKα/AMPKα比值,并下调p-mTOR蛋白表达及p-mTOR/mTOR比值,促进A549细胞自噬。且在加用AMPK抑制剂Compound C后,逆转了芹菜素对AMPK通路的激活作用,并抑制了A549细胞自噬水平,进一步证实芹菜素可通过AMPK/mTOR通路诱导A549细胞自噬。

4 结论

本研究表明芹菜素能抑制肺癌A549细胞增殖,诱导其自噬,其作用机制可能与激活AMPK/mTOR通路有关,为芹菜素在肺癌的临床应用提供了一定参考。但本研究仅为体外细胞实验,需进一步联合动物模型和临床实验进行探索。