基于网络药理学的复方血栓通胶囊治疗视网膜静脉阻塞机制研究*

陈雁君，刘求红，刘 红

1 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2 广州中医药大学第一附属医院眼科，广东 广州 510405

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是一种视网膜循环静脉回流受损的血管性疾病，其特征是视网膜静脉充盈和扩张，继发性视网膜出血、水肿和缺血，包括棉花斑、视网膜渗出和黄斑水肿［1］，是视网膜血管性失明的第二大诱因［2］。根据梗阻部位，可分为视网膜分支静脉阻塞（branch retinal vein occlusion，BRVO）、视网膜中央静脉阻塞（central retinal vein occlusion，CRVO），其中以BRVO 最常见。据估计［3］，世界范围内BRVO的患病率为0.4%，CRVO 约为0.08%。RVO的发病机制尚未明确，可能是由于静脉受压产生Virchow's三联征（瘀血、血管壁损伤和高凝），从而诱导静脉血栓形成导致血流部分阻塞［4］，其主要危险因素包括高血压、动脉硬化、糖尿病、高胆固醇。目前RVO治疗主要集中在减轻RVO并发症，通过玻璃体腔注射类固醇类药物或抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）来减少黄斑水肿、抑制新血管形成，但玻璃体腔注药存在疗效短、药物不良反应多、病情容易复发等问题，长期治疗仍具有挑战性。近年来，中医药因其临床疗效而逐渐受到人们的关注，成为一种重要的辅助疗法。

RVO 在中医学中称为“络损暴盲”，其基本病机为脉道阻滞，血溢脉外，其中“血瘀”是根本，治疗应“从瘀论治”，“活血化瘀”贯穿其中。复方血栓通胶囊是由三七、黄芪、丹参、玄参组成的中成药制剂，其中三七化瘀止血、丹参活血通经、玄参滋阴凉血、黄芪益气养血，4 药合用，活血祛瘀生新且不伤正气，共奏活血化瘀、益气养阴功效。临床研究表明复方血栓通胶囊能改善凝血及内皮细胞功能、抗血小板聚集，从而起减轻血液高凝状态、抗血栓形成，改善微循环的作用，此外还可提高组织耐缺氧及抗氧化能力，对缺血再灌注损伤组织具有一定保护作用［5-8］。

网络药理学是从分子水平探讨药物-成分-靶点-疾病之间的关系，可预测药物治疗疾病的潜在靶点，为中医药防治疾病提供理论依据［9］。因此，本研究采用该方法从分子水平探究复方血栓通胶囊治疗RVO 的潜在作用机制，为复方血栓通胶囊治疗RVO提供理论依据。

1 研究方法

1.1 复方血栓通胶囊的有效成分及其相关靶点收集通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分别以“三七”“黄芪”“丹参”“玄参”为关键词，根据药代动力学参数以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药物类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 为限定条件筛选获得复方血栓通胶囊的有效成分及其作用靶点。然后通过UniProt 数据库平台（https：//www.uniprot.org），限定物种为“Homo sapiens”，获取有效成分对应作用靶点的基因名。

1.2 RVO 疾病相关靶点收集以“retinal vein occlusion”“retinal vein obstruction”为关键词分别在Gene Cards 数据库平台（https：//www.genecards.org）、在线孟德尔人类遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM）（https：//www.omim.org/）及DrugBank 数据库平台（https：//go.drugbank.com）进行检索，去除重复靶点后获得与RVO相关的靶点基因。

1.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建利用R4.0.3软件运行R语言对疾病与药物的相关作用靶点取交集，并绘制Venn 图，然后利用Cytoscape 3.7.2软件制作出疾病-药物-成分-靶点网络图。

1.4 蛋白-蛋白互作网络(protein-protein interactions，PPl)构建将获取的药物-疾病交集的作用靶点导入String 11.0 数据库（https：//stringdb.org），限定物种为“Homo sapiens”，最低置信度设置为≥0.700，得到交集的作用靶点之间的蛋白互作网络信息，并通过R语言分析PPI网络，从而获得重要靶点信息。

1.5 复方血栓通胶囊治疗RVO 作用靶点富集分析利用Metascape 平台（https：//metascape.org/）进行药物-疾病靶点的基因本体论功能（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，然后根据P＜0.05 分别选取排名前10的3种GO富集分析结果和排名前15 的KEGG 通路富集分析结果，借助微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）分别绘制柱状图。

2 结果

2.1 复方血栓通胶囊有效成分、靶点信息通过TCMSP 平台筛选得到复方血栓通胶囊有效成分119个，其中三七9个、黄芪20个、丹参66个、玄参24 个，去除重复及无相应靶点信息后获得102 个有效成分，药物有效靶点202个。见表1。

表1 复方血栓通胶囊有效成分基本信息

2.2 RVO靶点信息RVO靶点信息通过GeneCards数据库获得1384个，OMIM数据库获得153个，DrugBank数据库32个，合并且去除重复后共得到1538个。

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络将药物有效靶点202 个和RVO 有效靶点1538 个，运用R4.0.3 软件运行R 语言得到药物-疾病交集靶点115 个，并绘制出Venn图。见图1。

图1 药物有效成分靶点和疾病靶点Venn图

将上述所得复方血栓通胶囊有效成分与药物-疾病交集靶点信息导入Cytoscape 3.7.2 软件绘制药物-成分-靶点-疾病网络，网络包含200个节点（1种疾病名，4个中药名，80种有效中药活性成分，115 个靶点）和893 条边。其中有效成分按Degree 值从高到低排序前10 名分别是A2（槲皮素，quercetin）、DS7（木犀草素，luteolin）、HQ13（山柰酚，kaempferol）、A3（黄芩素，baicalein）、DS54（β-谷甾醇，beta-Sitosterol）、HQ11（β-胡萝卜素，beta-carotene）、DS28（隐丹参酮，cryptotanshinone）、HQ7（甲基异微凸剑叶莎醇，7-Omethylisomucronulatol）、HQ5（异鼠李素，isorhamnetin）、DS32（二氢丹参内酯，dihydrotanshinlactone），说明这10 种有效成分可能是复方血栓通胶囊治疗RVO的关键成分。见图2、表2。

图2 药物-成分-靶点-疾病网络

表2 复方血栓通胶囊中20个关键活性成分

2.4 PPl 网络将115 个药物-疾病交集靶点导入String 11.0数据库，利用Cytoscape 3.7.2软件构建PPI 网络。通过R 语言分析PPI 网络中各靶点的连接节点数从而获得核心靶点信息，其中排名前10 的分别是Akt1（64）、TP53（63）、MAPK1（54）、MAPK8（54）、TNF（54）、IL-6（53）、VEGFA（52）、JUN（50）、STAT3（48）、EGF（46），说明10个靶点基因在复方血栓通胶囊治疗RVO中可能起重要作用。见图3。

图3 复方血栓通胶囊-RVO交集靶点PPI网络

2.5 GO 和KEGG 富集分析共得到2362 个GO 富集条目，其中涉及2142 个生物过程，包括凋亡信号通路、对无机物的反应、对脂多糖的反应、对活性氧的反应，细胞成分运动的正调控、细胞迁移的正向调节、对脂质的反应等；涉及146 个分子功能，包括转录因子结合、激酶结合、细胞因子受体结合、核受体的活性、转录因子活性等；涉及74 个细胞成分，包括膜筏、小凹、转录因子复合物、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合体、核转录因子复合体等。KEGG富集得到171个条目，涉及癌症相关通路、糖尿病并发症相关AGE-RAGE、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17、TNF、PI3K-Akt、MAPK 等信号通路。依据P值排名前20 的GO 富集分析和排名前20 的KEGG富集分析分别绘制成柱状图。见图4—5。

图4 GO富集分析结果

3 讨论

在RVO 的发生发展过程中，由于缺血缺氧可刺激炎症因子和新生血管生成从而出现黄斑水肿等并发症。本研究通过筛选得出槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、β-谷甾醇可能是复方血栓通胶囊治疗RVO 的关键性成分，具有抗炎、抗细胞凋亡、抗血管生成等生物活性。研究表明槲皮素可通过降低白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等炎症因子的过表达来抑制炎症反应，影响TLR4/核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、MAPK、PI3K-Akt 等通路来减少氧化应激，并通过调控B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Caspase、Bax 等蛋白的表达从而抗细胞凋亡，具有改善缺血再灌注损伤能力［10］。木犀草素具有舒张血管作用，并可通过增加一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）mRNA 表达来保护内皮细胞免受氧化应激损害［11］，此外还可抑制血管生成和与VEGF对接作用，靶向肿瘤信号通路，并具有一定抗癌作用［12］。山柰酚可通过调控NF-κB 及核转录因子2（nuclear transcription factor 2，Nrf2）/血红素氧化酶1（heme oxidase-1，HO-1）通路来抑制炎症和氧化应激，减轻百草枯诱导的血管损伤，说明其具有保护血管免受氧化损伤作用［13］。黄芩素可通过抑制AP-1转录活性从而抑制c-Jun、c-Fos表达，影响异二聚体形成和DNA结合亲和力，抑制THP-1CM 诱导的人脐静脉内皮细胞迁移和侵袭，从而在炎性微环境中发挥抗血管生成作用［14］。

通过疾病PPI网络分析得出，Akt1、TP53、MAPK1、MAPK8、TNF、IL-6、VEGFA、JUN、STAT3、EGF 等可能是复方血栓通胶囊治疗RVO 的关键靶点，主要通过IL-17、TNF、PI3K-Akt、MAPK 等信号通路影响氧化应激、炎症反应、新血管生成、细胞凋亡等过程，从而发挥治疗作用。

蛋白质激酶B（Akt）是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在细胞凋亡、增殖、迁移等过程中起重要作用，其与缺血性损伤中新生血管的形成密切相关［15］。研究发现，Akt 抑制剂可有效减轻氧诱导的视网膜新生血管形成［16］，Akt 是PI3K 下游的作用靶点，也是PI3K/Akt通路的关键蛋白，与MAPK、NF-κB 等通路密切相关。槲皮素通过抑制MAPKs、Akt 以及PI3K 激活使NF-κB 信号失活，从而有效抑制视网膜感光细胞中VEGF 诱导的过度炎症反应及血管平滑肌细胞增殖，抑制胶原蛋白合成和分泌［17］。可见复方血栓通胶囊可能通过上调Akt表达与影响PI3K-Akt通路达到抑制RVO产生新生血管及延缓动脉硬化的作用。

IL-6 是重要的炎症因子，可直接或间接诱导多种其他炎性细胞因子产生。IL-6一方面可直接影响内皮细胞功能，另一方面还可诱导VEGF 表达来增加血管通透性和促进血管生成，而且还与BRVO 和CRVO 中视网膜缺血的发展有关［18］。IL-17已被证明与眼部新生血管形成有关，可通过IL-17信号通路增强VEGF、ICAM-1、IL-6、IL-8 的表达来促进内皮细胞增殖、迁移，从而增加人视网膜毛细血管形成［19］。TNF-α是由巨噬细胞和T 细胞产生，是炎症和细胞凋亡中的主要细胞因子之一。研究发现，RVO 患者TNF-α 表达升高，在视网膜血管生成中作为重要的前血管生成因子起重要作用，可促进血管内皮细胞释放凝血因子，增加血管内皮细胞黏附分子表达，增强局部炎症反应［20］。槲皮素和黄芩素可有效抑制脂多糖诱导的TNF-α、IL-6转录和蛋白质合成，并且抑制一氧化氮的产生，从而抑制内皮细胞的炎症反应［21］。可见复方血栓通胶囊可能通过抑制炎症因子表达减轻RVO 引起的内皮细胞炎症反应。

VEGF 是内皮特异性有丝分裂原，是眼内血管增殖的主要信号。当组织缺氧时，可引起VEGF过表达，一方面诱导激活PI3K-Akt 通路，加速血管内皮细胞迁移和增殖，导致新的微血管腔形成［22］；另一方面可激活NF-κB 通路，调控下游血管细胞黏附分子-1表达，协同导致白细胞淤滞，加重视网膜血管闭塞及缺血［23］。研究表明RVO 的增殖反应由VEGF驱动，其表达与新生血管形成的严重程度成正比，并可协同其他血管通透性增强剂加速黄斑水肿形成［24］。研究表明木犀草素可有效阻断VEGFR 及其下游PI3K/Akt和PI3K/p70S6通路的激活，从而抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，也可通过稳定新生血管屏障透明质酸来抑制血管生成［12］。三七的活性成分三七总皂苷可抑制VEGF诱导的氧调节性视网膜新生血管形成，起到调节血脂的作用［25］。研究发现复方血栓通胶囊可抑制激光光栓形成，诱导RVO大鼠VEGF表达，对视网膜病变具有一定改善作用［26］。

综上所述，复方血栓通胶囊可通过干预多种靶点、调控多种通路途径，从氧化应激、炎症反应、新血管生成、细胞凋亡等过程治疗RVO。