不同益生菌对犊牛生长性能、消化代谢和免疫指标的影响

王丽娟,张永根

(1. 辽东学院农学院,辽宁 丹东 118001;2. 东北农业大学 动物科学技术学院,黑龙江 哈尔滨 150030)

近年来,如何完善犊牛早期开食料和日粮营养,提升犊牛消化功能,促进其营养吸收,同时降低应急,提高抗病力,解决犊牛腹泻的发生,减少抗生素使用,寻找绿色、健康、无残留“替抗”添加剂成为研究的热点[1]。益生菌作为一类犊牛开食料和断奶后日粮中的添加剂,对犊牛瘤胃生态系统的建立具有促进作用[2]。当益生菌进入动物机体时,会发挥生物拮抗作用,稳定肠道菌群结构,阻止病原体进入,使肠道微生态系统恢复健康状态[3]。美国农业机构和协会在1989年就公布了安全可饲用的44种益生菌菌种,2000年中国农业部将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和粪链球菌等16种微生态制剂的微生物列为饲料级微生物添加剂[4]。

不同益生菌对动物机体作用不同,如芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等是人和动物用的微生态制剂的生物菌株,乳酸菌有利于营养物质吸收和保健功能,芽孢杆菌和酵母菌可维持肠道厌氧环境、调节肠道pH值和微生态平衡、利于胃肠道对营养物质的分解、消化,粪肠球菌可显著提高仔猪免疫球蛋白含量[5]。不同种类益生菌在犊牛日粮中的应用比较研究还鲜有报道。因此,本试验以犊牛断奶前后日粮中添加6种益生菌对犊牛生长性能、消化率、氮代谢、免疫指标和腹泻发生情况进行综合评定,旨在为益生菌在犊牛日粮上的应用及对多种复合益生菌制剂犊牛开食料添加剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所有益生菌制剂由中国农业科学院兰州畜牧兽药研究所提供,粪肠球菌、腊样芽孢杆菌活菌数为1×109CFU/g,乳酸菌活菌数为1×1010CFU/g,地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌活菌数为2.0×1010CFU/g。

1.2 试验设计及试验日粮

试验采用单因素设计,选取42头20日龄荷斯坦犊牛(公母各半),按照出生胎次、出生重相近的原则分为7组,每组6头,公母各半,试验期85 d,其中预饲期10 d,正试期75 d。对照组饲喂基础日粮,试验组分别在基础日粮中添加0.1%枯草芽孢杆菌、0.05%腊样芽孢杆菌、0.2%乳酸杆菌、0.1%酵母菌、0.05%粪肠球菌和0.1%地衣芽孢杆菌,添加比例根据活菌数和益生菌制剂提供方建议确定。试验组和对照组基础日粮组成与营养成分见表1。将益生菌按照添加比例与精料混合进行饲喂,待精料全部采食完再投喂粗料,基础日粮中精粗比为55∶45,粗饲料为苜蓿和干草。

表1 基础日粮组成及营养成分Table 1 Composition and nutritional composition of basic diet

1.3 饲养管理

试验犊牛断奶前在犊牛栏中饲喂,每头犊牛单独饮水和食料,自由采食、饮水,断奶前牛奶巴氏消毒后进行人工灌服哺乳,每日早晚饲喂牛奶2次(7:30和17:00),20～50日龄每日饲喂6.5 L,50～60日龄(断奶)饲喂4 L。断奶后转入散栏饲养。

1.4 样品采集与测定

1.4.1 生长性能测定 分别在30日龄、60日龄(断奶)、105日龄空腹称体重(body weight,BW),测量体高、体斜长(硬尺),试验期详细记录每日每头牛开食料采食量,计算每头牛30～60、60～105日龄日增重(average daily gain,ADG)、干物质采食量(dry matter intake,DMI)、料重比(fuel-to-weight ratio,F/G)、体格(physical constitution,CP),断奶前料重比计算中平均日采食量不包括喂奶量。

料重比(F/G)=[平均日采食量(kg)/平均日增重(kg)]×100%

体格(CP)=体高(cm)×体长(cm)

1.4.2 营养成分测定 日粮和粪样的干物质(dry matter,DM)、有机物(organic matter,OM)、粗蛋白质(crude protein,CP)、粗脂肪(ether extract,EE)参考张丽英[6]的方法测定,中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)以及钙(Ca)、磷(P)按照Van Soest等[7]的方法测定。

1.4.3 粪尿样收集与分析 在60日龄和105日龄每组选择体重相近的3头试验牛进行2次代谢试验,采用消化代谢笼全收粪尿法收集粪尿,连续收集3 d粪尿,记录每天每头试验犊牛采食量、粪便排泄量、尿排泄量,收集每天粪样、尿样混匀样品各100 g、100 mL,分别加入50 mL、10 mL的H2SO4用于固氮,-20 ℃冷冻保存待测,粪样与尿样的CP含量均用凯氏定氮仪测定。DM消化率(DM,%)=(干物质采食量-粪中干物质排出量)/干物质采食量×100,OM消化率(OM,%)、NDF消化率(NDF,%)和ADF消化率(ADF,%)计算原理同DM消化率(DM,%)。

代谢体重(MW)=W0.75,W为体重

消化氮(DN,g)=摄入氮(NI,g)-粪氮(FN,g)

沉积氮(ND,g)=摄入氮(NI,g)-粪氮(FN,g)-尿氮(UN,g)

氮沉积率(NDR,%)=(沉积氮/摄入氮)×100

氮表观消化率(ADN,%)=(消化氮/摄入氮)×100

1.4.4 血样采集和测定 每组选择体重相近的3头试验牛于30、60和105日龄空腹使用抗凝采血管静脉采血10 mL,4 ℃下4 000 r/min离心15 min后提取血清-20 ℃保存待检,牛免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫分析试剂盒购自南京建成生物工程研究所,按照试剂盒使用说明书进行测定。

1.4.5 粪便评分和腹泻发生统计 试验期内,每日早晨饲喂前观察犊牛粪便情况,进行评分,评分标准见表2,当犊牛粪便评分>2时,记录为发生腹泻,评分为4时,按照诊疗方案进行治疗。

试验期内每组粪便指数=粪便评分之和/总头数

腹泻频率(%)=∑(腹泻头数×腹泻天数)/(试验头数×正试期天数)×100

1.5 数据统计

2 结果与分析

2.1 对犊牛生长发育性能的影响

由表3可知,30日龄(即试验开始犊牛日龄)、60日龄时各组犊牛体重无显著差异(P>0.05);试验结束105日龄时日粮中添加益生菌组犊牛体重高于对照组,其中乳酸杆菌组和粪肠球菌组显著高于对照组(P<0.05),其他组间差异不显著(P>0.05);60日龄时乳酸杆菌组体格显著高于对照组(P<0.05),105日龄时乳酸杆菌组体格显著高于腊样芽孢杆菌组和对照组(P<0.05),其他组间差异不显著(P<0.05);30～60日龄酵母菌组日增重极显著高于腊样芽孢杆菌组、地衣芽孢杆菌组和对照组(P<0.01),显著高于乳酸杆菌组、粪肠球菌组和枯草芽孢杆菌组(P<0.05),乳酸杆菌组、粪肠球菌组日增重显著高于枯草芽孢杆菌组、地衣芽孢杆菌组、腊样芽孢杆菌组和对照组(P<0.05);60～105日龄地衣芽孢杆菌组日增重显著高于酵母菌组和对照组(P<0.05),30～105日龄乳酸杆菌组、酵母菌组、粪肠球菌组和地衣芽孢杆菌组日增重显著高于枯草芽孢杆菌组和对照组(P<0.05);60～105日龄地衣芽孢杆菌组干物质采食量显著高于对照组(P<0.05),其他组间差异不显著(P>0.05);试验全期料重比各组间差异不显著(P>0.05)。

表3 日粮中添加不同益生菌对犊牛生长发育性能的影响Table 3 Effects of different bacteria added to diet on growth and development of calves

2.2 对犊牛消化代谢的影响

由表4可知,60日龄和105日龄时犊牛代谢体重差异不显著(P>0.05);105日龄时乳酸杆菌组、粪肠球菌组OM表观消化率显著高于对照组(P<0.05),60日龄时乳酸杆菌组有机物表观消化率显著高于酵母菌组和对照组(P<0.05);60日龄时乳酸杆菌组、酵母菌组NDF表观消化率显著高于对照组(P<0.05),105日龄时酵母菌组NDF表观消化率极显著高于对照组(P<0.01),提高了11.86%,乳酸杆菌组、粪肠球菌组显著高于对照组(P<0.05),其他组间差异不显著(P>0.05);105日龄时乳酸杆菌组、酵母菌组、粪肠球菌组和地衣芽孢杆菌组ADF表观消化率显著高于对照组(P<0.05);60日龄时各组摄入氮、粪氮和尿氮无显著差异(P>0.05),105日龄时摄入氮枯草芽孢杆菌组、乳酸杆菌组显著高于粪肠球菌组和对照组(P<0.05),105日龄时粪氮、尿氮和沉积氮各组间差异不显著(P>0.05);105日龄时枯草芽孢杆菌组、乳酸杆菌组和酵母菌组消化氮显著高于粪肠球菌组和对照组(P<0.05);60日龄时腊样芽孢杆菌组氮沉积率、氮表观消化率显著高于酵母菌组(P>0.05),分别高出20.52%、11.67%;105日龄时氮沉积率、氮表观消化率各组间差异不显著(P>0.05)。

2.3 对犊牛血清免疫指标的影响

由表5可知,30日龄各组犊牛IgG、IgM、IgA含量差异不显著(P>0.05),60日龄、105日龄时乳酸杆菌组、粪肠球菌组IgG含量显著高于其他试验组(P<0.05),极显著高于对照组(P<0.01),其他试验组显著高于对照组(P<0.05);60日龄时粪肠球菌组IgM含量显著高于对照组(P<0.05),粪肠球菌组、地衣芽孢杆和乳酸杆菌组菌组IgA含量显著高于对照组(P<0.05),其他各组间差异不显著(P>0.05);30日龄、105日龄时各组IgM、IgA含量差异不显著(P>0.05)。

表5 日粮中添加不同益生素对犊牛免疫指标的影响Table 5 Effects of different probiotics on immune indexes of calves

2.4 对犊牛腹泻发生的影响

由表6可知,各组都有腹泻发生,在腹泻程度上有一定差别,对照组腹泻频率要高于试验组,乳酸杆菌组和粪肠球菌组最低,酵母菌组和地衣芽孢杆菌组居中,枯草芽孢杆菌组和腊样芽孢杆菌组次之,粪便评分中对照组和腊样芽孢杆菌组较高,酵母菌组、乳酸杆菌组和粪肠球菌组相对较低。

表6 日粮中添加不同益生菌对犊牛腹泻发生频率和腹泻评分析Table 6 Analysis of diarrhea frequency and diarrhea evaluation of calves with different probiotics added to diet

3 讨 论

3.1 不同益生菌对犊牛生长发育性能的影响

犊牛生长发育性能与日粮、饲养环境和胃肠道对营养物质吸收能力有关。日粮中添加的饲用微生物一般统称为益生菌,也被称为竞争性细菌培养物。在动物日粮中添加益生菌可增强动物对其适口性,刺激食欲,进而提高采食量[8]。同时益生菌进入胃肠道后可产生有机酸,降低pH,抑制病原微生物生长,调节肠道微生物生态,提高肠道消化吸收能力,进而促进动物的生长发育[5]。本试验结果显示,日粮中添加不同益生菌在60日龄断奶前各组犊牛体重、体格发育上差异不显著,而在断奶后到105日龄犊牛日粮中添加益生菌对犊牛体重、体格发育上优于对照组,其中添加乳酸菌和粪肠球菌组体重显著高于对照组,这是因为乳酸菌和粪肠球菌被断奶犊牛摄入后在肠道内定植,通过调节肠道微生态区系来维护消化道的健康状况,改善了瘤胃菌群结构,提高了犊牛瘤胃有益菌群丰度,同时其代谢活动产生的有机酸、消化酶等物质能促进肠道对养分物质的消化吸收,从而提高动物生长性能[9],同时,每日摄入不同剂量的益生菌对犊牛生长性能也有显著的影响[10],并且犊牛断奶后由于断奶应激,会造成采食量下降、胃肠道菌群突变等。卢奇成等[11]研究表明,在犊牛日粮中添加布拉氏酵母菌可显著提高犊牛平均日增重和采食量,王晓芳等[12]将益生菌加入3～4月龄荷斯坦公犊牛的日粮中,可以显著提高犊牛的体斜长增长量。从本试验中也可以看出在断奶后试验组犊牛比对照组犊牛采食量高,这与额外添加益生菌促进了犊牛肠道和瘤胃发育、影响瘤胃微生物及代谢产物、改善肠道微生物菌群状况、促进营养物质吸收有关[13]。试验结果还显示,添加地衣芽孢杆菌组显著高于对照组,全期日增重试验组高于对照组,在采食量和日增重指标上添加地衣芽孢杆菌组表现更具优势,因为地衣芽孢杆菌可以提高犊牛瘤胃发酵参数的稳定性,促进了瘤胃纤维分解菌的定植和繁衍,调节瘤胃内环境、提高机体抵御饲养条件变化所带来的应激,进而促进犊牛健康生长[2],但是地衣芽孢杆菌自身不能在反刍动物瘤胃内定植,为使其在胃肠道中发挥作用,需要日粮中持续添加。本试验结果与Timmerman[14]发现添加益生菌可显著提高犊牛前期日增重,但随着日龄增加效果降低的研究结果有所不同。在整个试验期日粮中添加益生菌可有效降低料重比,乳酸菌组最低,3种芽孢杆菌组接近。于洁等[15]将丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌复合益生菌饲喂给肉鹅,也发现添加复合益生菌可以提高肉鹅总增重、空肠脂肪酶活性及抗氧化功能,添加枯草芽孢杆菌组可以更好地改善肠道形态。

3.2 日粮中添加不同益生菌对犊牛消化代谢的影响

益生菌进入反刍动物胃肠道后,不仅可以稳定瘤胃pH、氨态氮和挥发性脂肪酸浓度,改善瘤胃发酵环境和模式,还可以在肠道内繁殖,产生氨基酸等营养物质以及酶等,有效提高机体内脂肪和有机物的分解,进而提高机体对营养物质的利用率[16]。本试验结果显示,日粮中添加益生菌有效提高了犊牛对DM、OM、NDF和ADF的表观消化率,DM和OM的采食与消化能够反映胃肠道结构和机能的发育,同时也是衡量动物机体生产性能、健康状况及日粮利用效率的综合反映[17],DM和OM的采食与消化率的提高,说明添加益生菌对犊牛胃肠道的发育有促进作用。同时试验结果显示,添加酵母菌和乳酸菌组断奶后犊牛NDF和ADF表观消化率较其他试验组高,比对照组显著提升。相关研究表明,酵母菌和乳酸菌可促进断奶后犊牛瘤胃及肠道中主要的纤维分解菌在消化道中定植和生长,进而加快瘤胃发酵速度,增加了纤维分解菌和乳酸利用菌数量,提高挥发性脂肪酸产量,进而加快了NDF、ADF的表观消化率和降解率[18],这与孟竞尧等[19]研究结果相似,其利用复合益生菌饲喂4～6月龄犊牛,随着益生菌含量的增加,ADF表观消化率显著高于对照组。同时随着犊牛断奶后,瘤胃逐渐发育,益生菌对瘤胃的作用效果更加刺激了其对各类物质的分解,加快粗蛋白、粗脂肪的表观消化率[20]。本试验氮代谢结果显示,断奶犊牛日粮中添加益生菌可提高摄入氮含量,乳酸菌组达到显著水平,但在粪氮、尿氮上却差异不显著,说明氮主要以消化氮和沉积氮形式吸收,氮沉积率和氮表观消化率有所提高,说明益生菌对动物机体氮的利用率有所提升。

3.3 日粮中添加不同益生菌对犊牛免疫指标的影响

犊牛血清中免疫球蛋白的含量一方面可直接反应犊牛抵御疾病的能力和某些病例状态,也可以一定程度上反映机体蛋白代谢水平,间接反映机体免疫能力[21]。动物机体内参与体液免疫的蛋白主要为IgG、IgM和IgA,免疫球蛋白具有结合抗原、激活补体等生物学功能,动物机体内IgG、IgM和IgA水平提高可增强其健康性[22]。Matsuo等[23]通过对比检测腹泻犊牛与健康犊牛IgG、IgM、IgA含量发现,腹泻犊牛IgG含量显著低于健康犊牛。李洵[24]利用含布拉氏酵母菌与枯草芽孢杆菌的日粮饲喂犊牛,发现可提高犊牛血清中免疫蛋白含量。Sun等[25]发现芽孢杆菌能有效地提高巨噬细胞的数量及活性,通过产生抗体和提高噬菌作用刺激免疫系统,激发体液免疫和细胞免疫,从而增强动物免疫活性。IgM为初次免疫应答时最早出现的免疫球蛋白,虽持续时间较短,但在抗菌和抗病毒早期作用至关重要。本试验结果显示,在整个试验期,日粮中添加益生菌的犊牛IgG含量高于对照组,其中乳酸菌组和粪肠球菌组极显著高于对照组,说明日粮中添加乳酸菌组和粪肠球菌犊牛组血液中抗体水平有所增加,进而球蛋白含量也随之增加,说明日粮中添加乳酸菌和粪肠球菌对犊牛IgG含量影响较大;同时试验结果还显示粪肠球菌组60日龄时IgM、IgA含量也显著高于对照组,说明粪肠球菌对犊牛早期体液免疫反应有促进作用,这也可能是粪肠球菌在肠道内代谢繁殖过程中产生某些蛋白质和多肽类等物质刺激机体的免疫系统而导致的。史自涛等[5]研究表明断奶仔猪日粮中粪肠球菌含量升高时,可极显著增加血液中总蛋白和球蛋白含量,改善仔猪机体蛋白代谢,提高仔猪免疫力。

3.4 日粮中添加不同益生菌对犊牛腹泻发生的影响

犊牛粪便评分以及腹泻率是衡量其生长性能、发育状况的重要指标,益生菌进入犊牛胃肠道后,通过调节胃肠道优势菌群而形成一道天然防御屏障,抑制病原微生物在胃肠道上皮的定植和生长;通过控制有益菌群与有害菌群的比例来调节动物机体内微生物菌落平衡,促进犊牛肠道健康,提高消化功能,降低腹泻率的发生[26]。在犊牛早期日粮中添加布拉氏酵母能显著降低犊牛腹泻率的发生[27]。季彬等[28]研究表明,荷斯坦公犊牛日粮中添加0.05%、0.1%和0.2%复合益生菌均能够显著降低犊牛的腹泻率,且随着复合益生菌添加剂量的增加,犊牛腹泻率逐渐下降,表明益生菌能够提高犊牛的消化功能,降低腹泻率。犊牛日粮添加益生菌,虽然对犊牛粪便菌群微生物多样性无显著影响,但调整了粪便菌群和瘤胃菌群结构,提高了有益菌的相对丰度,降低病原菌的相对丰度,进而抑制肠道病原微生物生长,降低犊牛腹泻发病率[29]。本试验结果显示,日粮中添加益生菌有效的地降低了犊牛腹泻频率和腹泻发生概率,其中乳酸菌和粪肠球菌组腹泻频率和粪便评分数最低,这与乳酸菌和粪肠球菌可以产生有机酸和细菌素、降低肠道pH值、对大肠杆菌具有抑制作用有关。

4 结 论

益生菌对断奶后犊牛生长发育性能有促进作用,其中乳酸菌和粪肠球菌效果更明显;益生菌对犊牛DM、OM、NDF、ADF表观消化率及氮代谢有显著提升,粪肠球菌、酵母菌和乳酸菌在NDF和ADF表观消化率优于其他益生菌;添加粪肠球菌可提高犊牛免疫球蛋白含量,益生菌可以降低犊牛腹泻发生的概率,其中乳酸菌和粪肠球菌的效果更佳。