不同青贮饲料对奶牛瘤胃液微生物多样性的影响

周斐然,赵龙飞,张梦圆,张苏江

(1. 哈密市畜牧工作站,新疆 哈密 839000;2. 塔里木大学 动物科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)

瘤胃微生物是共生在牛、羊、鹿和骆驼等反刍动物瘤胃中的细菌和原生动物等微生物的总称,是反刍动物消化系统不可分割的一部分[1],能够满足反刍动物高达90%的代谢需求[2-3]。不同的品种、生长环境、饲养方式以及日粮中脂肪、粗纤维、蛋白质、淀粉的含量不同均可使瘤胃微生物群落产生显著差异[4]。瘤胃微生物最早是通过培养的方法研究,由于瘤胃器官是厌氧环境,因此瘤胃中绝大部分微生物在体外不易被培养。有研究报道,利用分子生物学方法,例如荧光定量PCR、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、克隆文库分析等可以初步了解瘤胃微生物信息[5-7]。其中,DGGE技术可以监测群落或种群结构动态,进行比较分析。qPCR技术可以用于检测和估计样本的相对丰度,但却极大限制了对瘤胃微生物在种类和数量上的研究。基于高通量测序技术可以通过提取特定环境中的微生物总DNA、构建文库,分析微生物群落种类、丰度及相关生物学信息,更容易获取体外无法培养的微生物信息,是目前研究特定环境微生物的重要技术手段[8]。

研究证明,不同品质以及不同品种的粗饲料可以改变宿主的瘤胃菌落、提高生产性能[9-10],瘤胃微生物菌群的种类和相对丰度对反刍动物饲料中营养物质的消化和吸收起着十分重要的作用[11]。薛树媛等[12]通过高通量测序分析了不同饲料对杜寒杂交肉羊瘤胃微生物区系的影响,发现玉米秸秆经过膨化及微生物发酵处理后明显改善了瘤胃微生物的丰度,不仅提高了瘤胃内有益菌群的数量,同时降低了有害菌群数量。赵娜等[13]基于16S rDNA测序技术发现,用青贮饲用油菜和青贮玉米饲喂山羊对瘤胃微生物的多样性影响不明显,饲用油菜具有更高的生物产量,具有较好的应用前景。甜高粱作为最具开发潜力的饲草资源之一,但基于高通量测序研究甜高粱对瘤胃微生物影响的报道较少。

本试验以荷斯坦奶牛瘤胃微生物为对象,对其进行16S rDNA高通量测序,分析其细菌菌群多样性和丰度,为奶牛瘤胃微生物多样性的研究奠定理论基础,同时找出优势菌群,探究饲喂不同粗饲料对瘤胃微生物的影响,为甜高粱饲料的科学开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

荷斯坦奶牛、MZS-玉米青贮、HSS-高糖甜高粱青贮、LSS-低糖甜高粱青贮以及试验所需的相关设备均来自于塔里木大学动物实验站。

以安装瘤胃瘘管的3头荷斯坦奶牛为试验样本,饲喂3种青贮类型日粮(玉米青贮MZS、高糖甜高粱青贮HSS、低糖甜高粱青贮LSS),日粮组成及营养水平具体见表1。试验采用3×3拉丁方设计,每期30 d,前21 d为预试期,后9 d为采样期,每3 d采1次样。试验奶牛饲养管理按常规方法进行。通过瘤胃瘘管采集瘤胃液,使用4层无菌纱布过滤,滤液分装于灭菌离心管中,保存于-70 ℃超低温冰箱中备用。

表1 3种试验日粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Component and nutrient level of three experimental diets (dry matter basis) %

1.2 DNA的提取与测序

1.3 测序结果

瘤胃微生物多样性采用16S rDNA高通量测序技术进行分析,通过瘤胃菌液DNA提取、引物设计合成、PCR扩增及纯化、产物定量与混合、构建Mise文库进行Miseq测序获取DNA片段序列。通过对原始数据进行拼接、过滤,得到有效数据,再对有效数据以16S rDNA序列97%的相似度进行划分。采用RDP classifier贝叶斯算法对相似的97%的OTUs进行分类学分析,了解每个样品的菌群组成。基于OTUs分析结果进行Alpha多样性分析,制作稀释性曲线(rarefaction curves),物种丰富度估计(species richness estimators)和群落多样性指数(community diversity indices),最后对门、属种分类的细菌类群统计比较分析,挖掘样品之间的物种组成差异进行关联分析。

1.4 数据处理

使用Excel 2016对不同瘤胃微生物数据进行整理,试验结果以平均值±标准差的形式表示,采用统计软件SPSS 23.0进行方差分析,采用Duncan法进行多重比较,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 高通量测序分析瘤胃细菌群落的多样性

2.1.1 OTU的Venn图 使用QIIME[14]软件对测序数据进行过滤,在97%相似度下对获得的有效序列进行聚类,获得1 784个OTUs(图1)。从图中可以看出MZS、HSS和LSS瘤胃液各组中高相似度的OTU有377个,说明3组试验组菌群的构成具有相似性及特异性,经计算相似OTUs占MZS瘤胃液总OTU的58.00%,占HSS瘤胃液总OTU的61.80%,占LSS瘤胃液总OTU的71.95%。

图1 不同样本OTU维恩图Fig.1 Venn of different sample OTU

2.1.2 样品的复杂度分析 稀释性曲线可用来评价测序数据量是否合理,同时反映各个样品中物种的丰富差异。稀释曲线是从样品中随机抽取一定测序量的数据,随着测序深度不断增加,OTUs数量逐渐增加。当曲线趋向平缓时,OTUs数量不再增加,表明测序深度已覆盖样品中大多数微生物,并且数据量合理。瘤胃液样品的OTU稀释曲线见图2A,3种样品稀释曲线有趋于平坦的趋势,且较为分散,说明所取的样本量足以覆盖所有的细菌,瘤胃液细菌多样性由多到少的排列顺序为:MZS>HSS>LSS。

图2 瘤胃液样品中细菌的复杂度A.稀释性曲线;B.Chao1曲线;C.Shannon-Wiener曲线Fig.2 Bacterial complexity of bacteria in rumen fluid samplesA. Rarefaction curves; B. Chao1 curves; C. Shannon-Wiener curves

Chao1曲线是度量物种丰富度的指标,间接可以反应样品中物种的稀有度。3种瘤胃液细菌的Chao1曲线(图2B)增幅差异较大,但在10 000序列后增幅逐渐变缓,在同一测序深度下3种瘤胃液样品细菌的丰富度、物种稀有度不同,且MZS>HSS>LSS。

3种瘤胃液样品的Shannon-Wiener曲线(图2C)数值先是直线上升直至趋向平坦,说明测序量足够大,能覆盖样品中绝大多数微生物信息。3种瘤胃液中细菌的多样性都比较丰富,其中最大的是玉米青贮瘤胃液,其次是高糖甜高粱青贮瘤胃液,最少的是低糖甜高粱青贮瘤胃液。

2.2 高通量测序分析瘤胃细菌群落的相对丰度

2.2.1 基于细菌门水平分类丰度 对样品中物种多样性信息进行分析,根据97%相似性将序列聚类为OTU,使用RDP classifier对序列进行物种注释。根据文库内所有序列得知,3个试验样品饲喂奶牛后瘤胃液中有16个门被鉴定,其中优势菌门4个(占细菌总数>1%),分别为厚壁菌门(45.75%),拟杆菌门(33.56%),变形菌门(16.07%),纤维杆菌门(1.03%)。3种瘤胃液样品同一门分类下克隆序列的数量及相对丰度见图3。

图3 瘤胃细菌门分类丰度统计图Fig.3 Abundance statistics of rumen bacterial phyla

瘤胃细菌在门水平的相对丰度统计表见表2。由图3和表2可见,各组奶牛瘤胃细菌在菌门水平物种组成上存在差异,LSS优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门,而HSS和MZS优势菌门为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和纤维杆菌门。HSS和MZS样品中的细菌在门水平上基本是相似的,而且二者样品中各类菌群的丰度很相近。HSS和MZS中的拟杆菌门、变形菌门、纤维杆菌门和螺旋体门的相对丰度显著高于LSS(P<0.05),而LSS奶牛瘤胃细菌中的厚壁菌门的相对丰度都显著高于HSS和LSS(P<0.05)。奶牛瘤胃液中总微生物丰度达到了99.79%,仅有0.21%的微生物未被分类,测序量能较好的覆盖样品内所有的细菌群类。被鉴定的16个菌门中HSS和LSS组仅有放线菌门(Actinobacteria)含量极少(细菌总数<0.01%),而LSS组中未检测到蓝藻门(Cyanobacteria)和迷踪菌门(Elusimicrobia),纤维菌门(Fibrobacteres)、螺旋体门(Spirochaetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、软壁菌门(Tenericutes)、SR1、TM7和WPS-2含量极少(见表2)。结果表明,相对于低糖甜高粱青贮,玉米青贮、高糖甜高粱饲喂荷斯坦奶牛瘤胃微生物丰富度相对较高。

表2 瘤胃细菌类群的门分类丰度统计表Table 2 Phylum abundance statistics of rumen bacterial taxa %

2.2.2 基于属水平上的相对丰度 试验奶牛瘤胃细菌类群在属分类水平上丰度统计结果见表3。LSS、HSS和MZS组之间奶牛瘤胃细菌在属水平组成上相对丰度差异显著(P<0.05),拟杆菌门中普雷沃菌属在MZS和HSS瘤胃液样本中是优势菌群,分别占29.26%和31.92%,显著高于LSS组的14.20% (P<0.05);HSS和MZS组奶牛瘤胃细菌中粪球菌属、解琥珀酸菌属、密螺旋体属、BF311和琥珀酸弧菌属相对丰度显著高于LSS(P<0.05),而LSS奶牛瘤胃细菌中的瘤胃球菌属和YRC22的相对丰度显著高于HSS和LSS(P<0.05)。

表3 瘤胃细菌类群的属(种)分类丰度统计表Table 3 Genus or species abundance statistics of rumen bacterial taxa %

从种分类水平来看,瘤胃液样品中共检测到了5种细菌,分别为产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes),黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens),反刍月形单胞菌(Selenomonasruminantium),普氏菌(Prevotellacopri),变异棒杆菌(Corynebacteriumvariabile)。其中,产琥珀酸丝状杆菌在MZS和HSS瘤胃液中分别占细菌总量的1.62%和1.43%,在LSS瘤胃液中含量极少;HSS组奶牛瘤胃细菌中黄色瘤胃球菌中占1.42%相对丰度显著高于MZS组和LSS组(P<0.05)。反刍兽月形单胞菌在LSS组奶牛瘤胃液中含量为细菌总量的0.14%,而在HSS和MZS组奶牛瘤胃液中含量极少,其余两种细菌在各组中含量都极少。

3 讨 论

基于16S rDNA高通量技术的测序与分析,对测序得到的序列进行筛选和拼接,获取OTUs条目绘制稀释性曲线,该技术在研究微生物多样性方面不仅快速方便,而且没有克隆误差[15]。Illumina单条测序的准确率仅有97.9%,而拼接双向测序结果时可显著增加序列的准确度至99.65%[16]。本试验利用Illumina高通量测序技术对奶牛瘤胃微生物细菌群落结构进行了研究分析,与传统方法[17-18]相比对瘤胃微生物的研究更全面。各组中Alpha多样性分析存在差异,表明饲喂不同类型的青贮饲料对瘤胃微生物群落存在影响,且各组中细菌多样性丰度排序为MZS>HSS>LSS。

甜高粱作为一种最具开发潜力的非粮作物,因其耐盐碱且生物产量高、饲用价值高,作为优质饲草料作物在盐碱地种植,既可解决粗饲料资源匮乏的问题,又可在盐碱地提高土地利用率,节约用水量,提高经济效益,进一步推动畜牧业饲草多元化健康发展[19-20]。除此之外,甜高粱经发酵后可产生许多种氨基酸,同时还能产生抗病因子以及促生长因子,有助于改善牲畜的营养健康状态,从而降低疾病的发生[21]。甜高粱青贮作为替代玉米青贮的研究较多,如王宏博等[22]在用甜高粱和玉米分别饲喂羔羊时发现,用甜高粱青贮替代玉米青贮对羔羊生产性能的影响差异不显著;杨宝钰[23]对比了甜高粱和玉米青贮对羊肉品质的影响,发现饲喂甜高粱组的羊肉品质明显高于饲喂玉米组。

有学者研究表明,瘤胃微生物在反刍动物瘤胃内中起重要作用,其中拟杆菌门和厚壁菌门为瘤胃液门水平优势菌群[24-25]。本研究发现以高糖甜高粱青贮、低糖甜高粱青贮和玉米青贮分别饲喂奶牛,提取的瘤胃液中微生物丰度都比较好,测序量能较好地覆盖样品内所有的细菌类群。3种瘤胃液样本中细菌主要分属厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、纤维杆菌门4个门。瘤胃中参与分解纤维素的细菌主要属于厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),2个门的细菌之间存在相互促进的共生关系,它们对消化道内的多糖进行发酵,共同为宿主吸收和储存能量[26]。高糖甜高粱和玉米青贮瘤胃液样品中拟杆菌门所占比例最大,分别占39.65%和40.51%,其次是厚壁菌门,分别占29.67%和32.87%,与Edwards等[27]和周熊艳等[28]研究的牛瘤胃优势菌群一致,但是所占比例不同,其主要原因可能是受到不同动物品种、日粮和环境等方面的影响。低糖甜高粱瘤胃液样品中细菌在门水平的相对丰度与高糖甜高粱和玉米青贮瘤胃液存在显著差异。3种瘤胃液样本中细菌在属(种)分类水平上主要是拟杆菌门的普雷沃菌属(Prevotella)和厚壁菌门的瘤胃球菌属(Ruminococcus);粪球菌属(Coprococcus)、解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、反刍杆菌属(Ruminobacter)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)等的相对丰度较低。普雷沃菌属和瘤胃球菌属在3种瘤胃液中都是优势菌群,分别在高糖甜高粱青贮中占31.92%和2.02%,玉米青贮中占29.26%和3.41%,低糖甜高粱青贮占14.20%和10.83%,能够降解非纤维素,在蛋白质降解以及果胶的利用等方面有着至关重要的作用[29]。瘤胃球菌属和解琥珀酸菌属被认为是瘤胃中降解木质纤维素的主要微生物,可产出大量的纤维素酶[30-31],可促进反刍动物对日粮的消化吸收。

从奶牛瘤胃液菌群多样性和丰富度差异对比,可以看出高糖甜高粱青贮和玉米青贮优势菌群相似性较高,其主要原因是充足的糖分能为青贮乳酸菌增殖提供充足的营养,青贮玉米籽实中包含丰富的淀粉来弥补其糖分含量较低的缺陷,青贮过程中乳酸菌快速增殖,乳酸含量明显增加,从而保证了青贮的成功率、感观质量和营养品质[32],致使瘤胃细菌菌群呈现出多样性。

4 结 论

不同粗饲料饲喂奶牛对其瘤胃微生物多样性有显著影响。奶牛瘤胃液细菌区系中主要含有厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、纤维杆菌门4个门,普雷沃菌属和瘤胃球菌属为已知属水平分类中的优势菌群。低糖甜高粱相较于高糖甜高粱和玉米青贮饲喂奶牛显著降低了奶牛瘤胃液细菌物种丰富度及细菌菌落多样性,而高糖甜高粱与玉米青贮瘤胃液中微生物多样性相似,可作为优质饲草代替玉米青贮饲喂奶牛。