不同果胶酶对低醇桑葚果酒品质的影响研究

王 宇，邹玉锋，张家旭，罗 静，许 强，袁天萌，边名鸿，韩保林*

（1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.成都蜀之源酒业有限公司，四川 成都 611335）

桑葚含有丰富的有机酸、矿物质、维生素和氨基酸等，不但营养丰富，而且具有良好的保健功能。由于桑葚季节性强且不易保存，将其加工成果汁、果脯、果酒等产品是提高其价值的主要途径[1-3]，其中低醇桑葚果酒因具有较高的营养价值和功能活性成分，受到诸多消费者喜爱[4]。同时，随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们更加追求健康营养的饮食，因此低醇桑葚果酒具有较大发展潜力[5]。但由于低醇桑葚果酒的发酵周期短、酒精度低，导致在发酵过程中花色苷和多酚类物质浸出量相对较少、色泽和香味物质含量低，影响产品的整体质量[6]。

果胶酶是一个多酶复合体系，在果酒加工过程中，果胶酶可以快速脱除果胶，降低果汁黏度，有利于后续产品的过滤和澄清[7-8]。果胶酶还能增加芳香物质、功能物质的浸提率，促进多酚类物质的释放，从而改善果酒的品质和成色[9]。LIU M M等[10]研究发现，添加果胶酶显著促进了柿子酒的澄清并使得苹果酸含量增加，同时降低了可滴定酸的含量。此外，还导致葡萄酒中主要的酚类化合物和抗氧化活性显著增加；曹力等[11]使用果胶酶对山茱萸果酒进行澄清处理并确定了最佳澄清工艺参数；韦婷等[12]研究发现，经果胶酶酶解后红阳猕猴桃出汁率和果酒感官评分的综合得分率提高，并且风味更加协调，同时其总酸含量降低，自然澄清度增加。因此，在低醇桑葚果酒酿造过程中，利用果胶酶对桑葚进行酶解，可以增加风味物质与功能性成分的溶出，是提升低醇桑葚果酒品质有效途径。

本研究采用7种果胶酶分别对桑葚进行酶解处理后发酵，对低醇桑葚果酒的理化指标、感官指标和挥发性香气成分的进行分析，以期为果胶酶在低醇桑葚酒生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚（无核大十）：采自四川省宜宾市长宁县；蔗糖：市售；安琪果酒专用酵母SY：安琪酵母股份有限公司；7种果胶酶样品（编号1～7号）：湖南鸿鹰生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

PHSJ—3F pH测定仪：上海精密科学仪器有限公司；NanoDrop2000分光光度计：美国Thermo Fisher Scientific公司；iNose电子鼻：上海瑞芬国际贸易有限公司；WZ101手持糖度计：海南博汉森科技开发有限公司；LRH-250生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；MJ-150I恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；7890A-5975B 气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美国Agilent科技有限公司；DZKW电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；50/30 μm DVB/CAR on PDMS顶空固相微萃取、固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手动进样柄和萃取头：上海安谱科学仪器有限公司；HJ-8B型恒温磁力搅拌器：金潭市正基仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低醇桑葚果酒的酿造工艺流程及操作要点

桑葚原料挑选→破碎打浆→调整成分→添加SO2→入罐→添加果胶酶→接种酵母→前发酵→过滤→后发酵→低温静置→陈酿→澄清处理→粗滤→精滤→低醇桑葚果酒

操作要点：

原料挑选：剔除腐烂、变质的桑葚，去除石子、树叶等异物。使用无菌水对桑葚进行简单冲洗，去掉表面泥土及污垢。

破碎打浆：沥干水分后在打浆机中低速打浆。

调整成分：使用蔗糖调整桑葚果浆初始糖度为140 g/L，用柠檬酸调节初始发酵pH为4.0，静置24 h。

添加SO2：添加偏重亚硫酸钾使发酵液中SO2含量达到60 mg/L。

酵母活化：将果酒酵母与等质量蔗糖混合，用10倍质量、35～40 ℃的无菌水溶解，静置20 min。

接种酵母：将不同酶解处理的发酵液装于250 mL锥形瓶中，装液量为75%，将活化好的酵母按1%的接种量接种到发酵液中。

前发酵：于20 ℃恒温培养箱中发酵7 d。

后发酵：用8层纱布进行过滤，在4～8 ℃条件下发酵7 d。

陈酿：发酵结束后，在4 ℃条件下避光陈酿30 d，期间每隔7 d倒罐一次。

澄清、过滤：经陈酿果酒澄清、粗滤、精滤后得到低醇桑葚果酒。

1.3.2 理化指标

总酸、总糖、酒精度：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；颜色参数、总花色苷、多酚、总黄酮：参照田琳等[13-14]的方法测定；所有指标均重复测定3 次。

聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）酶活：参照丁平等[15]的方法利用3,5-二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）测定；果胶裂解酶（pectate lyase，PL）酶活：参照何玉兰[16]的方法测定；果胶甲酯酶（pectin methyles-terase，PME）酶活：参照孙凯[17]方法利用点位滴定法测定。

1.3.3 感官品评

选择10名经过专业培训的人员（年龄在20～45岁之间）组成感官品评小组。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官分级评价描述以及时蒙蒙等[18]的方法进行修改，从桑葚酒色泽、香气、滋味、典型性等方面进行感官品评分析，总分即为酒样的得分，结果取10名人员的平均值，满分100分。

1.3.4 挥发性香气成分的测定[17]

（1）挥发性香气成分提取

取不同果胶酶预处理的低醇桑葚酒样品各5mL于15mL顶空萃取瓶中，添加1.0 g NaCl，放入搅拌子，在40 ℃条件下加热平衡15 min，然后将萃取针头插入顶空瓶中，萃取30 min，磁力搅拌速度为800 r/min。

（2）挥发性香气成分GC-MS分析

气相色谱条件：DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），萃取头解吸5 min，进样口温度250 ℃，载气为氦气（He），载气流量为恒定流速1.0 mL/min，不分流进样。程序升温：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min 升至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持7 min。

质谱条件：5973 型四极杆质谱仪，接口温度250 ℃，电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1 353 V，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围33～450 amu。

定性定量方法：根据所得谱图与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库检索进行定性分析，实验结果保留与数据库对比匹配度＞80的鉴定结果。采用面积归一法定量分析。

1.3.5 数据整理与统计分析

采用Microsoft Excel 2019整理实验数据，采用SPSS 26软件进行数据显著性分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。采用Origin2021绘图。

2 结果与分析

2.1 不同果胶酶酶活测定

果胶酶是一个多酶复合体系，各类酶活力的大小确定其基本性质，7种果胶酶的聚半乳糖醛酸酶活性、果胶裂解酶活性、果胶甲酯酶活性测定结果见图1。

聚半乳糖醛酸酶（PG）是一种水解酶，作用于果胶并水解聚半乳糖醛酸中的半乳糖醛酸残基间的α-（1-4）糖苷键[19]。由图1A可知，5号、6号和7号果胶酶的PG酶活性较高，分别为33 183 U/g、26 854 U/g、27 329 U/g，具有较强的澄清果汁能力。

果胶裂解酶（PL）作用于酯化的多聚半乳糖醛酸第5位的β-碳原子，使β-碳原子上的氢原子转移到糖苷键的氧原子上，在半乳糖醛酸的C-4和C-5之间形成双键，从而导致α-1,4糖苷键断裂[20-21]。由图1B可知，4号和5号果胶酶的PL酶活较高，分别为10 640 U/g和2 721 U/g，可更好地促进酚类、黄酮类、花色苷的溶出。

果胶甲酯酶（PME）也属水解酶类，其作用是水解果胶分子聚半乳糖醛酸聚糖中甲酯化的羧基，使其甲酯化的糖醛酸残基生成聚半乳糖醛酸和甲醇，可加速PG降解果胶速度[22]。由图1C可知，3号、5号和6号果胶酶的PME酶活较高，分别为2 961 U/g、3 242 U/g和4 559 U/g。而2号和4号果胶甲酯酶活力最低，仅为376 U/g和0 U/g。

2.2 不同果胶酶处理的低醇桑葚果酒理化指标

由图2A可知，不同果胶酶处理后的低醇桑葚果酒花色苷含量差异不显著（P＞0.05）；酒精度为6.02%vol～8.06%vol，均高于对照组（（5.8±0.18）%vol）。原因可能是由于果胶酶催化水解桑葚中的聚半乳糖醛酸，促进了桑葚中糖分的释放[23]。由图2B可知，3号、4号和5号果胶酶处理后的低醇桑葚果酒总黄酮含量较高，分别为（170.04±3.54）mg/100 mL、（175.42±5.48）mg/100 mL和（179.41±4.25）mg/100 mL；4号、6号、7号和对照组果胶酶处理后的低醇桑葚果酒多酚含量较高，其中采用4号果胶酶处理后发酵的低醇桑葚果酒多酚含量最高，为（159.84±4.87）mg/100 mL。由图2C可知，3号、5号果胶酶处理后的低醇桑葚酒总酸较高，4号果胶酶处理后的低醇桑葚酒总酸略低于3号、5号果胶酶处理后的低醇桑葚酒，总糖略低于5号果胶酶处理后的低醇桑葚酒。由图2D可知，4号果胶酶处理后的低醇桑葚酒色泽最为红亮，其亮度值和红绿值高于其他组，分别为0.18±0.02和0.35±0.01。

图2 不同果胶酶处理对低醇桑葚果酒花色苷和酒精度（A）、总黄酮和总多酚（B）、总酸和总糖（C）、色值和色差（D）影响Fig.2 Effects of different pectinases on anthocyanins and alcohol content (A), flavonoids and polyphenols (B), total acidity and total sugar (C),and color value and color difference (D) of low-alcohol mulberry wine

2.3 不同果胶酶处理的低醇桑葚果酒挥发性香气成分的影响

果酒香气是影响果酒品质和风味的重要因素，主要有果香、酒香和陈酿香。果酒香气的影响因素除了原料本身以外，还有原料的处理方法，发酵及陈酿等处理方法[21-22]。桑葚经过不同的果胶酶处理后，发酵液中的花色苷含量和多酚类物质含量有所改变，所得低醇桑葚果酒的挥发性香气成分也因此存在差异[18]。不同果胶酶处理对低醇桑葚果酒挥发性香气成分GC-MS测定结果见表1。

表1 不同果胶酶处理低醇桑葚果酒的挥发性香气成分比较Table 1 Comparison of volatile aroma components in low-alcohol mulberry wine treated with different pectinases

由表1可知，在不同果胶酶处理后的低醇桑葚果酒中，酯类物质在果酒香气中占主导，乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯和棕榈酸乙酯含量相对较高，这些物质带有令人愉悦的花香和果香，对低醇桑葚果酒的香气有一定贡献[6，26-27]。4号果胶酶处理后的酯类相对含量最高，种类也最为丰富，为13种。其原因可能是桑葚中果胶结构高度酯化，而果胶水解酶对果汁的水解速率及程度随着果胶酸酯化程度的增加而降低，但是果胶裂解酶对甲酯基的α-1,4糖苷键有着较强的专一性，能够通过反式消除反应促使果胶的D-半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键的裂解，从而释放更多的风味物质、多酚类物质，使得低醇桑葚果酒有着更好的色泽、口感和香气[28]。

酸类物质一部分源于原料，一部分是酵母菌在生长发酵过程中代谢产生，是酯类物质的前体物质。在不同果胶酶处理后的低醇桑葚酒中都存在乙酸和辛酸，当这些酸适量存在于果酒中时，对果酒风味有积极影响[29]。当酸类物质的含量低于阈值时，可使酒中的各种香气趋于协调、平衡，过量的酸类物质则对果酒的风味和品质带来负面影响。4号果胶酶处理后的低醇桑葚酒中，乙酸及其他酸类物质相对含量较其他组低，感官分析中酒体也表现出适度的酸度。因此，4号果胶酶的使用能有效减少酸类物质含量，改善酒体风味。

高级醇是果酒中香味来源之一，是果酒中重要的风味物质，可以通过氨基酸转化和糖代谢产生[30]。若高级醇含量过低，则果酒酒体风味淡薄；若含量过高，则会带来异味，且会使饮酒者头疼和醉酒[31]。在不同果胶酶处理后的低醇桑葚果酒中，异丁醇、异戊醇、丁二醇和苯乙醇等高级醇的含量突出，他们都具有相应的醇香和水果香[32-33]。4号果胶酶处理后发酵得到的低醇桑葚果酒中，异戊醇和苯乙醇含量最高，相对含量分别为11.83%和9.63%，这两种醇分别具有白兰地香气和玫瑰香气。

2.4 不同果胶酶处理的低醇桑葚果酒香气分析

电子鼻是测定食品风味的一项快速检测技术，能够客观并快速地对样品的气味进行评价[34]。14根传感器对8个样品的检测信号值见图3A。由图3A可知，8个样品大致都在S1、S2、S4、S5、S8和S11对应的感应值较高。其中4号果胶酶处理后的低醇桑葚果酒在S1芳香族化合物、S2氮氧化合物、S4有机酯和萜类化合物、S5萜类酯类的响应值较其他组高，说明4号果胶酶处理后的低醇桑葚果酒中风味物质更加的丰富。对8种低醇桑葚果酒进行主成分分析，结果见图3B。由图3B可知，主成分总方差贡献率达到96.5%，识别指数（discrimination index，DI）值达到97.6%，各酒样在坐标系上分离程度大，说明不同果胶酶处理桑葚原料发酵的低醇桑葚果酒差异较大，电子鼻能将不同果胶酶处理的低醇桑葚果酒区分开。

图3 不同果胶酶处理的低醇桑葚果酒电子鼻检测的挥发性物质雷达图（A）及主成分分析（B）Fig.3 Radar chart (A) and principal component analysis (B) of volatile compounds detected by electronic nose in low-alcohol mulberry wine treated with different pectinases

2.5 不同果胶酶处理的低醇桑葚果酒的感官评定

7种不同果胶酶处理的低醇桑葚果酒感官评定结果如表2所示。由表2可知，4号和6号果胶酶处理的低醇桑葚果酒的感官评分显著高于其他组（P＜0.05）。从色泽方面，7种果胶酶处理后发酵的低醇桑葚果酒色泽都呈宝石红，且有光泽，与色度分析一致。但香气和滋味方面，4号和6号果香和酒香更加协调，滋味更加的丰满醇厚，4号的典型性最好，具有典型桑葚果酒风味。

表2 不同果胶酶处理对低醇桑葚果酒感官评价结果的影响Table 2 Effect of different pectinases treatment on sensory evaluation results of low-alcohol mulberry wine

3 结论

解析7种不同果胶酶酶系及活力大小，并利用7种果胶酶对桑葚原料进行处理，探究果胶酶对低醇桑葚果酒的影响。不同果胶酶处理桑葚原料对低醇桑葚酒品质的影响差异较大，由于不同种类的果胶酶对桑葚组织细胞中的聚半乳糖醛酸的作用效果不同，导致最终低醇桑葚果酒的酒精度、黄酮含量、多酚含量和花色苷含量等有所不同。其中，经过4号果胶酶处理后的低醇桑葚果酒，其总黄酮含量、总多酚含量和花色苷含量较高，分别为175.4 mg/100 mL、159.8 mg/100 mL和125.5 mg/L。通过GC-MS和电子鼻对酒体进行了风味成分分析，以4号果胶酶处理后发酵得到的低醇桑葚果酒的风味物质最为丰富，感官评分最高（85.0分）。综上，果胶酶的使用在一定程度上改善低醇桑葚酒的理化性质及酒体风味，提升低醇桑葚酒品质，但对最佳酶系构成及其具体使用条件需进一步探索。