耐高温和耐低温固体复合菌剂对牛粪堆肥的影响

岳世林,马晓勇,姜国均

(河北农业大学 动物医学院,河北 保定 071000)

堆肥处理是养殖场处置粪便最普遍方式,具有处理成本低、能杀灭病原菌、有效降解有机污染物等优点,在我国河北、内蒙古等省区应用广泛[1]。但北方地区秋冬季节气温偏低,导致堆肥发酵慢、效率低,在低温条件下将牛粪顺利堆肥是一个亟待解决的关键问题[2]。牛粪中的纤维素、木质素等难降解物质主要在高温期进行分解,但由于温度过高,大部分微生物无法生存,因此解决高温期微生物存活也具有重要意义。本试验将筛选出耐高温和耐低温菌添加到牛粪中,研究低温下两者结合对牛粪堆肥发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 牛粪

经过干湿分离含水率为60%的新鲜牛粪,由河北农业大学试验牛场提供。

1.2 耐高温和耐低温菌

本试验从牛粪堆肥过程的高温和低温期初选出耐高温和耐低温菌种,通过菌株鉴定、淀粉水解、纤维素降解、蛋白质水解和拮抗试验,最终筛选出8株细菌。耐高温菌为嗜热链球菌和地衣芽孢杆菌P8-B2,耐低温菌包括地衣芽孢杆菌DSM13、地衣芽孢杆菌MRPDSCV17203、巨大芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌AYYT-1、蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。各种细菌生长到对数期80%时,置4 ℃保存备用。

1.3 复合菌剂制备

将干燥细麸皮和细锯末高压灭菌,取400 g加入100 g葡萄糖与耐高温菌混合,记为X1;取细麸皮和细锯末1 200 g,加入300 g葡萄糖与耐低温菌混合,记为X2。将葡萄糖作为发酵引物,用适量蒸馏水与固体基质混合均匀,含水量为60%,分别在培养箱中培养24 h,耐高温菌55 ℃培养,耐低温菌25 ℃培养。将混合好的固体取出,在烘箱中以25 ℃和55 ℃进行烘干,将含水量为0%的X1和X2在常温下混合均匀,固体复合菌剂制备完成。

1.4 堆肥及样品采集

2020年12月进行堆肥处理,堆肥期22 d。堆肥当天记录为第1天,定时取样,理化指标采样时间为第0、5、10、15、20天,试验组设为T组,对照组设为C组。高通量测序采样时间为堆肥初期(T1、C1)、升温期(T2、C2)、高温期(T3、C3)、降温期(T4、C4)和腐熟期(T5、C5)5个时期,试验组、对照组和每一个堆肥时期均做3个重复;从堆体四个角和中心部位(15、30、45 cm)处分别取样,将同时期不同部位的样品均匀混合,一部分-20 ℃保存用于理化指标检测,另一部分-80 ℃保存,用于高通量测序分析物种组成和各阶段优势微生物。

T组:固体复合菌剂与牛粪混合均匀,取约170 kg牛粪进行堆肥,菌剂接种量约为0.94%;C组:添加等量细麸皮、细锯末和葡萄糖与牛粪混合均匀。

1.5 理化指标测定

试验期每天在9:00和17:00各测量1次,测量所有取样点求平均值作为当天的堆温并测量室温;pH采用pH计测量;含水率采用105 ℃烘干法进行测定;总有机碳和全氮测定参考国家标准GB13193-91和农业行业标准NYT 297-1995;有机质测定为有机碳×1.724;全磷和全钾测定参考农业行业标准NYT 298-1995、NYT 299-1995;种子发数指数(GI)参照王雪的方法测定[3]。每项指标分别重复3次测定。

1.6 数据预处理

采用T-test进行显著性分析,显著性分析采用SPSS软件,柱状图和折线图采用GraphPad软件,稀释曲线、物种组成及优势微生物分析采用软件QIIME2。

1.7 物种组成及优势微生物

采用派森诺生物有限公司(上海)Illumina平台Miseq进行16S rRNA测序。通过上机检测得到各样本有效数据分析物种组成和优势菌群。

2 结果与分析

2.1 理化指标

2.1.1 温度 由图1可见,堆肥过程需要22 d,两组堆肥温度变化趋势基本一致,先升高后降低。T组和C组第1天堆温分别为28.3和21.0 ℃;T组温度快速上升,比C组提前两天到达高温阶段,第5天进入高温期温度为55.3 ℃,第8天达到堆肥最高温59.7 ℃,高温阶段持续7 d;C组第7天温度为55.3 ℃,第9天达到最高温56.3 ℃,高温阶段持续5 d,基本符合我国《粪便无害化卫生标准(GB7959-87)》。表明添加复合菌剂可以迅速启动堆肥初始温度,提高堆肥最高温并延长高温时间。

图1 堆肥过程中温度的变化

2.1.2 pH 由图2可见,本次堆肥中pH先升高再降低。初始pH在8.0左右,随着堆肥过程的进行,第5天试验组pH与对照组相比显著升高(P<0.05),其他时间段试验组与对照组均无显著行差异。pH第10天达到最大值,随后pH一直下降,在结束时降到最低值,维持在8.0～8.5之间。

图2 堆肥过程中pH的变化

2.1.3 含水率 由图3可见,堆肥初始含水率均约60.0%,2组堆肥含水率变化趋势基本一致。堆肥结束时,C组含水率下降了18.4%,T组最终下降了24%,第5、10、15天2组差异显著。表明在牛粪堆肥过程中,添加该复合菌剂可促进水分挥发。

图3 堆肥过程中含水率的变化

2.1.4 碳氮比 由图4可见,堆肥过程中C/N变化规律是一直下降,初始牛粪C/N无显著性差异,第5、10、15天时,试验组相比对照组显著降低(P<0.01),第20天无显著差异,本次试验初始C/N值C组和T组分别为32.0和32.4,堆肥结束时C组和T组C/N值分别为16.4和15.1。表明添加菌剂后堆肥C/N下降更快。

图4 堆肥过程中C/N的变化

2.1.5 有机质 由图5可见,堆肥过程有机质含量呈缓慢减少趋势。第0天、20天时,T组相比C组无显著性差异,第5天、10天时T组相比C组极显著降低(P<0.01),第15天T组相比C组显著降低(P<0.05)。C和T初始含量分别为682.3、682.5 g/kg,最终含量分别为567.7、559 g/kg,分别下降了114.6、123.5 g/kg,早期堆肥牛粪中所含的大量易分解的有机物迅速分解下降快。

图5 堆肥过程中有机质的变化

2.1.6 全磷 由图6可见,堆肥过程中全磷含量呈上升趋势。第0～5天T组相比C组无显著性差异,第10天T组相比C组显著升高(P<0.05),第15天、20天时T组相比C组无显著性差异。C组和T组初始含量分别为54.4、55.3 g/kg,最终含量分别为63.1、66.1 g/kg。表明在堆肥过程中,添加菌剂可提高总磷含量。

图6 堆肥过程中全磷的变化

2.1.7 全钾 由图7可见,堆肥过程中全钾含量呈上升趋势。所有时间段T组相比C组均无显著性差异。C组和T组初始含量为7.4 g/kg,最终含量分别为11.0、11.6 g/kg。表明在堆肥过程中添加菌剂对总钾含量影响不大。

图7 堆肥过程中全钾的变化

2.1.8 种子发芽指数(GI) 由图8可见,堆肥过程中GI呈上升趋势。第0天和20天时T组相比C组无显著性差异,第5天和15天T组相比C组显著升高(P<0.05),第10天时T组相比C组极显著升高(P<0.01)。C组和T组初始GI分别26%和26.3%,最终GI分别为88.2%和92.7%,第0～10天两组上升幅度最大,说明高温期对GI起关键作用,堆肥结束时两组的GI均已超过80%,可视为该牛粪已无植物毒性或者牛粪已经腐熟。

图8 堆肥过程中GI的变化

2.2 高通量测序分析

2.2.1 稀释曲线 由图9可见,C1和T1曲线最低,依次逐渐升高,最高的是C5和T5。表明本次试验的测序量达到符合反映本次试验中牛粪菌群的多样性组成水平。

图9 Alpha指数稀疏曲线

2.2.2 物种组成及优势微生物 由图10可见,C组和T组门水平牛粪堆肥样品中物种组成及优势微生物。共检出31个门,本图仅显示丰度最高前10个。物种组成主要包括:变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌(Actinobacteria)、绿湾菌门(Chloroflexi)、Thermi、柔膜菌门(Tenericutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。各种菌群多样性在C组和T组的变化规律基本一致,但是丰度占比有很大差异。Proteobacteria是两组各阶段的优势微生物,占比均为58.0%相差不大;Bacteroidetes存在各阶段,但是高温期的丰度占比最高,C3和T3丰度分别为32.5%和35.5%;Firmicutes在堆肥结束几乎不存在,为堆肥初期(C1、T1)和升温期(C2、T2)优势微生物,C1、T1、C2、T2丰度分别为17.9%、24.4%、13.0%、14.4%;Actinobacteria是初期、降温期(C4、T4)和腐熟期(C5、T5)优势微生物,丰度占比均为8.0%左右相差很小;Chloroflexi是降温期和腐熟期优势微生物,C4、T4、C5、T5丰度分别为11.2%、12%、13.3%、20.3%。试验表明加入复合菌剂会改变细菌生长繁殖情况,改变各菌种在不同堆肥阶段丰度占比,增加优势微生物数量。

图10 门水平物种组成

由图11可见,C组和T组属水平牛粪堆肥样品中物种组成及优势微生物。共检出41个属,本图仅显示丰度最高前10个。物种组成主要包括:其他菌(Others)、假单胞菌属(Pseudomonas)、放线菌属(Acinetobacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、鲁氏丝状杆菌(Ruminofilibacter)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、栖海面菌属(Aequorivita)、藤黄色单胞菌属(Luteimonas)、B-42和棒状杆菌属(Corynebacterium)。除了Others占比最高外,Pseudomonas升温期的优势微生物,C2和T2丰度分别为22.0%和23.0%;Acinetobacter、Psychrobacter和Corynebacterium是初期的优势微生物,C1和T1丰度分别为10.1%、23.4%、17.0%、15.0%、4.9%和5.2%;Cellvibrio是高温期的优势微生物丰度为T3 6.0%和C3 5.0%;Ruminofilibacter降温期和腐熟期的优势微生物,丰度由1.0%上升至C5中3.7%,由7.0%上升至T5中10.0%;藤黄色单胞菌属(Luteimonas)和B-42在各组各阶段占比很小,但依然可以看出是高温期及降温期的优势微生物。试验说明,在堆肥前加入复合菌剂会改变各种微生物在堆肥不同时期的丰度占比,优势微生物数量增加。

图11 属水平物种组成

3 讨 论

在冬季进行牛粪堆肥,添加复合菌剂的试验组与对照组相比,堆温迅速升高,高温期持续时间延长,C/N、含水率、有机质含量下降快,GI上升,尤其是GI明显提高,随着堆肥反应的进行,牛粪堆肥堆体 TP、TK含量均呈上升趋势,这主要由于牛粪进行堆肥过程中,有机C、有机N 和有机P均被微生物同化吸收及异化分解,但对K元素吸收利用率很低,微生物对有机C、N、P的需求高于对有机K的需求,K元素在堆肥过程中基本无损耗,添加微生物没有显著改变,而微生物对有机C的需求高于对有机N的需求,也高于对有机P的需求,一般需求比例为 C:N:P=100:5:1[4],在堆肥降解过程中有机C的降解速率高于有机N,高于有机P,导致堆肥过程中有机P的损耗率低于有机C和有机N,所以牛粪堆肥堆体TP含量均呈上升趋势,添加复合菌剂后变化趋势一致,可以显著降低C/N,因此TP含量显著升高[5];各菌群丰度变化明显。大多数的研究都是将耐高温菌或耐低温菌其中一类菌添加在牛粪中验证堆肥效果,很少有研究将二者放在一起制成复合菌剂,分析对堆肥发酵的影响。本试验通过将耐高温菌和耐低温菌混合制备固体复合菌剂添加在牛粪中,在冬季进行堆肥发酵,即验证制备的菌剂在冬季的堆肥效果。事实上微生物代谢是堆肥性质变化的根本原因[6],微生物通过代谢有机物来释放能量和养分,从而促进堆肥的成熟,堆肥的成熟反过来促使微生物生长和繁殖[7],Jusoh等[8]研究结果表示接种菌剂有利于堆肥矿化作用,缩短堆肥腐熟时间5～8 d,刘阳等[9]研究表明,添加耐低温复合细菌可以有效促进堆肥在低温条件下的温度升高,并加速高温时期的开始,周伏忠等[10]通过添加自研的耐高温微生物制剂来发酵鸡粪生产有机肥料,获得了良好的结果,与本试验结果基本一致,说明添加耐低温菌和耐高温菌对堆肥发酵有促进作用。本试验筛选的细菌只有一株是链球菌,其余几株均为芽孢杆菌,与Jing等[11]研究结果基本一致,研究发现芽孢杆菌是原始堆肥高温期的主要优势菌,可能与芽孢杆菌耐高温和耐低温的生长特性有关,也可以在低温环境良好生长,同时由高通量测序分析高温期的优势微生物是Bacteroidetes,与本试验筛选的菌基本相符,芽孢杆菌属,可以延长高温堆肥时间,对指导微生物菌剂在堆肥中应用和进一步提高堆肥效率具有重要意义[12]。嗜热链球菌是一株高产胞外多糖的发酵菌株[13],常做为酸奶的发酵剂之一,被广泛的应用于发酵乳制品加工当中[14],而在工业发酵中研究较少,本试验在牛粪堆肥发酵高温期中筛选到该菌,并发现对粪便中纤维素有一定的降解作用,因此可以继续研究该菌在堆肥发酵中的作用。本试验中筛选到耐高温菌2株,可继续进行筛选,耐低温菌可以从多个环境中筛选,如直接从冻土中筛选,但能否在堆肥过程中存在,与牛粪中固有菌是否互利共生,还需要更进一步的研究。

4 结 论

本研究表明,添加佐剂成功制备耐高温和耐低温堆肥发酵固体微生物复合菌剂,缩短了堆肥时间,提高了堆肥效率和有机肥品质。堆肥温度和微生物数量是堆肥成功的关键。