血清白细胞介素-35、乳酸脱氢酶在骨髓增生异常综合征120例中的临床意义

王宁，匡歆，赫宁宁

作者单位：青岛市胶州中心医院检验科，山东 青岛266300

骨髓增生异常综合征（MDS）是起源于造血干细胞的肿瘤性疾病，其主要特征是骨髓造血功能异常、血细胞发育异常，且高风险向急性髓系白血病（AML）转化［1］。MDS 病情具有多样性，且众多病人病情危险程度不一，临床常给予个体化治疗以延缓病情进展为主［2］。因MDS 存在极大异质性，尽管目前已推广出众多治疗方案，仍有部分病人治疗疗效和生存时间存在显著差异［3］。因此，临床应探究与MDS 病人疗效有关的指标，评估病人治疗失败风险。修订的国际预后积分系统（IRSS-R）被认为是评估MDS 预后的金标准，但其评估标准是否适用于化疗或靶向治疗等病人依然未知，以此成为应用局限。研究指出，MDS 发病机制主要涉及造血前体细胞的特定分子缺陷，不同免疫途径均参与其中，自身免疫异常和T细胞介导的免疫抑制被认为是MDS的主要特征［4］。白细胞介素（IL）-35 属于Ⅰ型细胞因子受体，主要在细胞相互接触时大量生成，可促进效应T细胞活化、成熟［5］。有研究发现，IL-35与免疫负向调节有关，可通过抑制辅助性T 细胞17（Th17）分化而产生免疫抑制作用［6］。韩冰等［7］研究发现，MDS 仍存在病态造血、原位溶血及细胞过度损害等病理反应。乳酸脱氢酶（LDH）是人体组织中细胞代谢酶，其活性增高常见于白血病、恶性肿瘤等疾病，尤其可反应细胞增殖、代谢异常，与骨髓原位溶血、红细胞破坏等紧密相关［8］。由此推测，IL-35、LDH 可通过增强免疫抑制途径和加速细胞损坏，促进MDS 病情进展，影响治疗效果。本研究将分析血清IL-35、LDH 与MDS 病人治疗效果的关系，评估MDS治疗失败风险，制定后续干预方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取青岛市胶州中心医院2019 年5 月至2020 年5 月收治的128 例MDS 病人作为研究对象。纳入标准：①MDS 符合《骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南（2019年版）》［9］中相关诊断；②伴有贫血相关症状，如乏力、疲倦等；③参照上述指南在医院接受个体化治疗，治疗期间同步进行随访；④入院时预计生存周期＞6 个月。排除标准：①合并白血病或实体恶性肿瘤；②合并急性感染；③合并先天性免疫功能缺陷；④合并先天性造血干细胞功能障碍；⑤合并其他血液疾病；⑥合并自身免疫性疾病；⑦合并其他骨髓疾病；⑧长期接受激素治疗者。剔除标准：①发生任何不良反应需停止用药；②随访期间突发重大疾病需停止观察；③随访期间全因死亡；④病人或其近亲属主动要求退出研究。本研究病人或其近亲属知情同意，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 设计调查问卷，统计病人临床资料：年龄、性别（男∕女）、WHO 分型［MDS 伴单系发育异常（MDS-SLD）∕MDS 伴多系发育异常（MDSMLD）∕MDS 伴原始细胞过多-Ⅰ（MDS-EB-Ⅰ）］、WHO 分型预后积分系统（WPSS）［9］、IRSS-R 评分［9］、危险程度［较低危（IRSS-R≤3.5 分）∕较高危（IRSS-R＞3.5分）］［9］。

1.2.2 MDS 治疗及预后评估方法 （1）治疗方案：研究中120 例病人均参照《骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南（2019 年版）》［9］在医院接受个体化治疗：对于较低危病人以改善造血，提高生活质量为治疗目标，包括成分输血、造血生长因子、去铁治疗等，对于存在输血依赖性贫血，且对细胞因子治疗效果不佳病人可采用免疫调节剂治疗，如来那度胺治疗，28 d 为1 个疗程。对于较高危病人以降低病情向AML 转化风险，改善生存为治疗目标，采用去甲基化药物治疗，如5-阿扎胞苷（AZA）、5-阿扎-2-脱氧胞苷（地西他滨）等药物；AZA 治疗：用法用量为皮下注射AZA（Celgene Europe BV，批号H20170238），75 mg·m-2·d-1）×7 d，28 d 为1 个疗程。（2）疗效评估［9］：治疗6 个疗程时参照指南中疗效标准评估治疗效果，分为完全缓解（CR）：原始细胞≤5%且所有细胞系均成熟，血红蛋白（Hb）≥110 g∕L、血小板（PLT）≥100×109∕L、中性粒细胞绝对计数（ANC）≥1.0×109∕L、原始细胞为0；部分缓解（PR）：外周血绝对值持续≥2个月、其余条件达到CR标准但原始细胞较治疗前仅减少≥50%，仍＞5%不考虑骨髓细胞增生程度；疾病稳定（SD）：未达部分缓解最低标准但至少8周病情未进展；治疗失败（failure）：治疗期间病死或病情进展，主要表现为血细胞进一步减少、骨髓原始细胞增高等。根据病人治疗效果分为治疗有效组（CR、PR、SD）和治疗失败组（Failure）。

1.3 研究相关实验室指标检测方法治疗前，采集病人空腹外周静脉血8 mL分别放置于两支试管中，取其中一支试管采用全自动血细胞分析仪（南京贝登医疗股份有限公司，BH-5360）检测全血白细胞（WBC）：参考值（4～10）×109∕L、ANC：参考值（1.8～6.3）×109∕L；取 另 一 支 试 管 以3 500 r∕min速率离心10 min 分离血清和血浆（离心半径为10 cm），血浆中加入抗凝剂，采用全自动血细胞分析仪检测血浆红细胞（RBC）：参考值男（4.3～5.8）×1012∕L；女（3.8～5.1）×1012∕L、Hb：参考值男130～175 g∕L；女115～150 g∕L、PLT：参考值（125～350）×109∕L，采用连续检测法测定血清LDH 水平，采用酶联免疫吸附法检测血清IL-35水平，LDH参考为120～250 U∕L、IL-35正常值为3.3～200.0 ng∕L，试剂盒均购自南京贝登医疗股份有限公司。

1.4 样本量估算使用Kendall 粗略样本量估算方法，样本量为自变量的5～10倍，本研究以MDS病人治疗效果作为因变量，纳入的自变量包括一般资料（6项），检测指标（7项），共计13项，考虑到10%的失访病人，研究至少需纳入72～143例病人，以2019年5月至2020年5月收治的128例MDS病人作为研究对象。

1.5 统计学方法采用SPSS 25.0 统计学软件处理数据，采用例（%）表示计数资料，采用χ2检验，等级资料采用秩和检验；采用Shapiro-Wilk 正态分布检验计量资料的正态性情况；符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较以独立样本t检验；非正态分布计量资料采用中位数（第25、75 百分位数）、即M（P25，P75）表示，组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义；血清IL-35、LDH 与MDS病人治疗效果的关系，采用logistic 回归分析检验；绘制受试者操作特征（ROC）曲线，并计算曲线下面积（AUC），获取血清IL-35、LDH预测MDS 病人治疗失败的最佳阈值；采用限制性立方样条函数评估血清IL-35、LDH 与MDS 病人治疗效果的OR值关系，采用样条函数与logistic 回归相结合的限制性立方样条法分析自变量与因变量之间关系，以估血清IL-35、LDH最佳阈值为参考值，采用限制性立方样条法分析血清IL-35、LDH 与MDS病人治疗效果的剂量反应关系。

2 结果

2.1 MDS病人治疗效果128例MDS病人，治疗期间2 例要求退出研究，2 例因使用来拿度胺发生PLT减少，1例发生中性粒细胞减少症，需停止用药，3例失访，共剔除8 例病人，以120 例病人为实际研究对象。120 例MDS 病人，于治疗6 个疗程时，CR 占12例（10.00%）、PR 占60 例（50.00%）、SD 占20 例（16.67%）、Failure 占28 例（23.33%）；治疗失败组占23.33%（28∕120），治疗有效组占76.67%（92∕120）。

2.2 治疗有效组和治疗失败组一般资料比较治疗失败组WPSS评分、IRSS-R均高于治疗有效组，较高危病人占比多于治疗有效组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组其他资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 骨髓增生异常综合征120例中治疗有效组和治疗失败组一般资料比较

2.3 治疗有效组和治疗失败组实验室指标比较治疗失败组全血ANC，血浆Hb、PLT 低于治疗有效组，血清IL-35、LDH表达量高于治疗有效组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组其他指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 骨髓增生异常综合征120例中治疗有效组和治疗失败组实验室指标比较∕ ± s

表2 骨髓增生异常综合征120例中治疗有效组和治疗失败组实验室指标比较∕ ± s

注：WBC为白细胞，ANC为中性粒细胞绝对计数，RBC为红细胞，Hb为血红蛋白，PLT为血小板，IL-35为白细胞介素-35，LDH为乳酸脱氢酶。

组别治疗失败组治疗有效组t值P值LDH∕（U∕L）347.22±31.82 315.58±26.03 5.34＜0.001例数28 92 WBC∕（×109∕L）6.65±0.64 6.43±0.56 1.84 0.069 ANC∕（×109∕L）0.43±0.11 0.54±0.13 3.91＜0.001 RBC∕（×1012∕L）3.87±0.32 3.78±0.30 1.36 0.176 Hb∕（g∕L）85.61±5.31 89.34±6.44 2.78 0.006 PLT∕（×109∕L）82.62±3.72 85.80±4.47 3.43 0.001 IL-35∕（ng∕L）140.03±11.75 128.17±10.63 5.04＜0.001

2.4 各指标与MDS 病人治疗效果关系的logistic回归分析以MDS 病人治疗效果作为因变量（1=治疗失败，0=治疗有效），将差异有统计学意义的指标纳入作为自变量，经logistic 回归分析显示，MDS 病人治疗失败与全血ANC，血浆Hb、PLT 低表达，血清IL-35、LDH高表达有关（P＜0.05）。见表3。

表3 各指标与骨髓增生异常综合征120例治疗效果关系的logistic回归分析

2.5 血清IL-35、LDH 联合预测MDS 病人治疗效果以MDS 病人治疗效果作为状态变量（1=治疗失败，0=治疗有效），将血清IL-35、LDH 作为检验变量，绘制ROC 曲线图发现，血清IL-35、LDH 单独及联合预测MDS 病人治疗失败风险的AUC 分别为0.77、0.79、0.83，当二者截断值分别取129.70 ng∕L、324.28 U∕L时，可获取最佳预测效能。见表4。

表4 血清IL-35、LDH联合预测骨髓增生异常综合征120例治疗效果

2.6 血清IL-35、LDH 与MDS 病人治疗效果的剂量反应关系以血清IL-35、LDH 最佳截断值129.70 ng∕L、324.28 U∕L 为参考值，采用样条函数与logistic 回归相结合的限制性立方样条法，分析血清IL-35、LDH 与MDS 病人治疗效果的剂量反应关系。血清IL-35、LDH 连续变化与MDS 病人治疗失败的关联强度成线性剂量反应关系（P＜0.05）；血清IL-35、LDH 与MDS 病人治疗失败呈显著正相关，当血清IL-35＞129.70 ng∕L、血清LDH＞324.28 U∕L 时，MDS病人治疗失败风险随血清IL-35、LDH升高而升高。

3 讨论

文献指出，MDS 病人自然病程和危险层级差异有统计学意义，治疗宜个体化，以改善自然病程、血液学质量及生存质量为主［10］。然而目前MDS 治疗方案存在多样性，不同病情病人所制定治疗方案不同，整体疗效难以提升，这也导致MDS 病人预后产生一定差异［11］。为评估MDS 病人整体治疗效果，郑丽坤等［12］研究发现，80 例MDS 病人治疗24 个月时疾病进展率高达31.25%。但本研究中，120 例MDS病人治疗失败率约23.33%，与上述研究不同原因在于，病人危险层级、观察周期等差异，但上述研究数据均表明MDS 的整体治疗收益有待提高，探究与MDS病人治疗效果有关的指标十分必要。

研究指出，自身免疫异常参与骨髓造血抑制与疾病进展，其中Tregs 细胞在维持免疫耐受、调节T细胞稳态等方面具有重要作用，能够抑制免疫效应细胞对异常发育克隆细胞的清除能力，促进MDS 病情进展［13］。IL-35 为IL-12 家族成员，与其他家族成员不同，IL-35 是由Tregs 分泌的免疫抑制性细胞因子，能够抑制T 细胞增殖及向Th1、Th17 细胞分化，诱导Tregs 增殖，以发挥免疫抑制作用［14］。除此之外，IL-35 能够诱导新型Tregs（即iTR35）生成，即使无Tregs 存在，iTR35 仍可发挥强大免疫抑制效应，加重疾病进展［15］。近年来，Ye 等［16］研究证实，高浓度的IL-35可有效抑制T细胞增殖，增强免疫抑制作用。LDH 为糖代谢中重要酶系之一，广泛存在于器官和骨骼肌等组织中。早在2011 年，Kim 等［17］研究证实，LDH 与白血病病情进展有关，通过参与RBC、PLT 损伤而增加出血风险，加重白血病病情。近年来研究发现，LDH 与MDS 发病风险有关，可进一步引起细胞损伤，从而加重MDS病情［18］。

本研究中，治疗失败组血清IL-35、LDH 表达均高于治疗有效组，也进一步证实血清IL-35、LDH 与MDS 病情进展有关。与此同时，治疗失败组较高危病人居多，该结果也表明较高危病人血清IL-35、LDH水平普遍较高。这可能与血清IL-35、LDH参与MDS病情进展有关。结合上述研究结果认为，IL-35通过增强免疫抑制作用，导致异常发育克隆细胞增生，从而导致MDS 病情进展，增加病情危险程度。LDH 介导RBC、PLT 等细胞损伤参与MDS 的发病过程，增加病情危险程度。这也成为较高危病人治疗失败普遍较多的主要原因。为进一步明确血清IL-35、LDH 与MDS 的关系，经logistics 回归分析显示，MDS病人治疗失败与血清IL-35、LDH高表达有关。

目前认为IL-35、LDH 通过以下机制参与MDS进展，影响治疗效果：（1）IL-35：IL-35 可通过抑制细胞毒性T 细胞过度增殖及CD4+细胞分化为Th 或Th17 效应细胞，发挥免疫抑制作用，从而加速异常发育细胞克隆和血细胞损伤，以此加重MDS 危险层级，最终增加治疗难度［19］。IL-35与Treg可相互上调表达，诱导T 细胞转化为iTR35 细胞，构成机体免疫调控网络，进一步加重免疫抑制，加重MDS 病人细胞损伤，从而增加治疗难度［20］。Egwuagu 等［21］研究显示，IL-35 可协同Treg 发挥免疫抑制作用，从而加重相关疾病病情。（2）LDH：LDH 升高与细胞结构和功能改变有关，LDH 在RBC 红含量比正常血清中活性高出1 000 余倍，LDH 升高可导致RBC 过度损伤，从而加重MDS 病情进展［22］；除此之外，LDH 通过糖酵解可产生大量乳酸，而乳酸可通过促进异常发育细胞增殖、转移，从而加速MDS 病人骨髓细胞损伤，利于病情恶性发展，增加临床治疗难度［23］。为明确LDH 与MDS 病人预后的关系，陈春平等［24］研究发现，血清LDH高表达可作为MDS病人病死的危险因素。由此可见，血清LDH 高表达一定程度上增加MDS病人治疗失败风险。

本研究在最后通过绘制ROC 曲线获取血清IL-35、LDH 预测MDS 病人治疗失败的最佳阈值，结果显示，当二者截断值分别取129.70 ng∕L、324.28 U∕L 时，在预测MDD 治疗失败时可获取最佳预测效能，由此认为，临床在预测MDS 治疗效果时，不仅可采用ANC、Hb、PLT 等指标，仍可将血清IL-35、LDH水平作为参考，以提高预测效能。然而本研究中，血清IL-35、LDH 预测MDS 病人治疗失败的灵敏度偏高，特异度偏低，这是由于IL-35 属于天然免疫和适应性免疫反应中重要细胞因子，在MDS 中免疫反应可有效激活IL-35 导致其水平升高，这也是导致其灵敏度偏高的原因。而LDH 是机体损伤的重要标志物，机体几乎所有脏器损伤均可导致LDH 升高，在MDS 中，骨髓细胞损伤导致造血功能和免疫功能等多系统功能障碍，这是造成LDH 灵敏度偏高的原因之一。此外，本研究为明确血清IL-35、LDH与MDS 病人治疗效果的关系，采用限制性立方样条分析显示，血清IL-35、LDH 与MDS 病人治疗失败风险呈线性剂量反应关系，由此可见，临床在治疗MDS 前可考虑优先获取血清IL-35、LDH 最佳阈值，评估MDS 病人治疗失败风险，从而制定更加有效的干预方案，以改善治疗预后。

本研究虽证实血清IL-35、LDH 与MDS 病人治疗效果的关系，但由于观察周期较短，尚未针对血清IL-35、LDH 实施针对性干预，并观察病人治疗效果。与此同时，本研究为单中心研究，能够提供的MDS 样本量有限，这也导致本研究结果一定程度上与后期研究产生差异，此为本研究的局限。今后研究将联合多中心开展，扩增样本量，继续延长随访周期，将血清IL-35、LDH 作为MDS 病人治疗靶点之一，进一步评估病人治疗效果，为探究MDS 治疗方案提供新的参考。

综上所述，MDS 治疗失败与血清IL-35、LDH 高表达有关，血清IL-35、LDH 高表达与MDS 病人治疗失败风险呈线性剂量反应关系，临床中或可以血清IL-35、LDH 作为MDS 的潜在治疗靶点，通过改善血清IL-35、LDH 水平，延缓MDS 病情进展，尽可能降低治疗失败风险。