超敏酶标术中快速免疫组化技术在临床工作中的应用

施洋，严永敏

1.镇江市第一人民医院病理科，江苏镇江 212000；2.江苏大学医学院检验医学系，江苏镇江 212013

术中冰冻诊断，又称为冰冻切片诊断，是一种在手术过程中迅速处理并切割组织样本，然后通过快速冷冻和切片技术，使其可以在短时间内进行病理学检查以做出初步诊断的方法[1]。但是在实际操作中，由于冰冻切片在制作过程受到多种因素干扰，会造成细胞或组织结构出现变化，并对术中冰冻诊断造成困难，这就需要选择更为科学有效的方式进行评估，术中免疫组化技术在手术中非常有用，可以帮助医生在手术进行中获得即时的组织学信息，从而指导手术决策[2]。而快速免疫组化技术是一种在生物医学研究和临床诊断中常用的技术，用于检测组织样本中特定蛋白质的存在和分布情况，这就需要在免疫组化过程中选择合适的材料进行抗体制备[3]。纳米超敏感辣根过氧化物酶多聚体技术是一种在快速免疫组化中应用的高灵敏度技术，其可以增强免疫组织化学信号，从而更准确地检测目标蛋白质的存在和分布[4]。因此，本文选取2022 年2 月—2023 年5 月镇江市第一人民医院诊治的162 例术中肿瘤疑似患者作为研究对象，针对超敏酶标术中快速免疫组化技术在临床工作中的应用价值展开分析。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院诊治的162 例术中肿瘤疑似患者为研究对象，所有研究对象均予以快速免疫组化检测，并以石蜡免疫组化法检测结果作为金标准，恶性82例，良性80 例。恶性患者男29 例，女53 例；年龄26～86 岁，平均（55.27±18.12）岁。良性患者男25例，女55 例；年龄26～85 岁，平均（55.04±18.01）岁。本研究所选病例经过本院医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：经手术进行治疗；基本信息资料完整；同意参与本文研究，并签署知情协议。

排除标准：对手术不耐受者；合并慢性疾病者；存在精神或语言障碍，无法沟通者。

1.3 方法

肺鳞癌采用细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6,CK5/6）标记，肺腺癌采用甲状腺转录因子1（transcription termination factor 1, TTF1）标记，口腔肿瘤采用广谱细胞角蛋白（CKpan）标记，甲状腺癌采用细胞角蛋白19（recombinant cyokeratin 19, CK19）标记，脑肿瘤采用胶质纤维酸性蛋白（general framework agreement for peace, GFAP）标记，乳癌前哨淋巴结采用广谱细胞角蛋白（CKpan）标记。

试剂选择：快速免疫组化试剂盒TTF1、CK19、CKpan、CK5/6、GFAP 均来自贵州美鑫达医疗公司。石蜡免疫组化试TTF1、CK19、CKpan、CK5/6、GFAP，鼠兔通用型Envision 二抗、DAB 显色试剂盒均来自福州迈新公司。

（1）快速免疫组化检测：①经6 μm 冰冻组织切片后，将样本放置于专用的固定液中浸泡1 min。②再经磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS-T）清洗30 s。③在通用免疫组化封闭液中浸泡1 min。④置入辣根过氧化物酶多聚抗体后，于室温内孵育3 min。⑤经PBS-T 清洗30 s，反复共计3 次。⑥加入双组分金属增强（two component metal reinforced DAB）显色液1 mL DAB 缓冲液中加入30 μL DAB 原液）显色3 min。⑦经两次水洗，并予以苏木素复染。⑧最后进行一次水洗，予以脱水、透明、封片后，对样本进行阅片评估。

（2）石蜡免疫组化法检测：选择徕卡公司全自动免疫组化仪（BOND-MAX）进行试验，根据相关操作流程予以染色后阅片评估。

1.4 观察指标

结果判读：在检测中以石蜡免疫组化法结果为金标准，通过双盲法进行评估，由两位高级职称检测医师进行评估，对免疫组化结果进行判读标准阅片，分别针对阳性结果定位、表达强度、阳性细胞百分比以及组织背景等4 个指标进行分析，对比术中快速免疫组化法结果与石蜡免疫组化法符合率数据差异。诊断准确度=（真恶性例数+真良性例数）/总数×100%；诊断灵敏度=真恶性例数/（真恶性例数+假良性例数）×100%；诊断特异度=真良性例数/（真良性例数+假恶性例数）×100%。并计算两种检测技术的Kappa 值。

1.5 统计方法

选择SPSS 22.0 统计学软件分析数据。用例数（n）和率（%）评价计数资料，并通过χ2检验。用（±s）评价计量资料，计量资料符合正态分布，并通过t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方式结果对比

经检测确诊肿瘤类型：肺鳞癌12 例，肺腺癌12例，甲状腺癌21 例，脑癌9 例，口腔癌5 例，乳癌前哨淋巴结23 例。超敏酶标术中快速免疫组化法：真阴性79 例；假阳性1 例；真阳性81 例；假阴性1例，其中超敏酶标术中快速免疫组化法检测准确度为98.77%。见表1。

表1 不同检测方式结果对比

2.2 不同检测指标符合率对比

超敏酶标术中快速免疫组化法诊断各类型恶性肿瘤符合率较高。见表2。

表2 不同检测指标符合率比较[n（%）]

3 讨论

术中冰冻诊断是通过快速冷冻和切片技术，使其可以在短时间内进行病理学检查以做出初步诊断的方法，这种方法在肿瘤疾病的手术治疗中具有十分重要的作用[5]。这就需要在手术过程中通过快速免疫组化技术对组织样本进行检查，常规检测中是选择石蜡免疫组化法进行评估，通过对组织切片中特定蛋白质的存在和分布进行显微镜观察和分析[6]。但是在实际的手术中发现，部分常规石蜡切片使用的免疫组化试剂在较短的时间内无法充分发生抗原抗体反应，这就导致抗体表达强调下降的情况，甚至会有假阴性表达的情况，这给免疫组化技术在术中快速冰冻诊断中的使用带来了困难[7-8]。

纳米超敏感辣根过氧化物酶多聚体技术是一种在快速免疫组化中应用的高灵敏度技术，其可以增强免疫组织化学信号，从而更准确地检测目标蛋白质的存在和分布[9]。辣根过氧化物酶是一种常用的酶标记物，用于免疫组织化学中。在纳米超敏感技术中，辣根过氧化物酶被修饰成多聚体形式，也就是多个辣根过氧化物酶分子聚集在一起形成高密度的酶标记物[10]。多聚体化的辣根过氧化物酶可以产生大量的酶反应产物，从而极大增强信号强度，这种放大效应使得目标蛋白质的表达水平即使很低，也能在组织切片中得到可靠的检测结果[11]。本研究结果显示：阳性定位指标符合率为92.68%（76/82）；表达强度指标符合率为87.80%（72/82）；阳性细胞百分比指标符合率为95.12%（78/82）；组织背景指标符合率为85.37%（70/82）。其中，超敏酶标术中快速免疫组化法在阳性结果定位更为准确，存在个别组织样本在取材以及制片期间存在操作失误造成定位不清的问题，以甲状腺组织样本中出现更多[12]。在针对表达强度指标进行评估时，腺癌比其他肿瘤更容易出现强度下降的情况，造成表达强度指标符合率不高，但是其他类型组织强度适中。在针对阳性细胞百分比指标进行评估时效果良好；而在染色背景方面符合率为85.37%，其中部分组织表现出一定程度的非特异性染色情况，以脑组织、淋巴结组织出现较多。说明纳米超敏感辣根过氧化物酶多聚体技术的应用可以提高免疫组化的灵敏度，使得检测到的蛋白质信号更为明确和可靠，这对于病理学诊断中需要检测低表达蛋白质的情况特别有用，其中超敏酶标术中快速免疫组化法检测准确度为98.77%[13]。云海龙等[14]在针对157 例肿瘤患者进行研究后发现，选择术中快速免疫组化法进行检查的符合率为91.72%，与金标准数据结果相比，差异无统计学意义（P＞0.05），结果数据与合本文研究一致。此外，超敏酶标还可以在快速免疫组化中发挥加速的效果，因为多聚体化的辣根过氧化物酶可以加速酶反应速度，从而缩短染色和显微镜观察的时间[15]。数据显示：术中快速免疫组化法检测所需时间低于石蜡免疫组化法。

综上所述，在针对恶性肿瘤疾病进行术中检测时，选择超敏酶标予以快速免疫组化能够具有较高的符合率，检测所需时间更低，表达更为准确，建议在术中冰冻诊断中作为重要的辅助诊断依据。