白城山新1号杨增殖培养试验

王 利,张玉玲,包 颖,岳 龙,孙 鹏,王新波

(1.白城市林业科学研究院,吉林 白城 137000; 2.吉林省林业技术推广站,吉林 长春 130022; 3.舒兰市林业局,吉林 吉林 132000)

杨树具有易栽培、好管理、生长快、适应性强等优点,是我国北方地区的主要绿化树种[1]。但普遍存在观赏性差、扬粉飞絮等问题,严重影响了城乡绿化美化效果。白城市林业科学研究院经过20多年选育出白城山新杨系列品种(白城山新1号杨Populusdavidiana×P.bolleana‘baichengshanxinyang No.1’、贵妃杨),该品系树干通直饱满,树皮光滑细腻,淡绿色,披白粉;树冠紧凑,宽窄适中,整洁优美;密枝型,枝叶繁茂翠绿。其最突出的特性是雌株不结实、不飞絮。白城山新杨用于城市绿化可以密植,能够降低交通噪音污染,但该品系扦插繁殖不易生根,导致常规难繁,一直没能推向绿化苗木市场。植物组培工厂化育苗技术体系,是以植物细胞、组织、器官等为外植体,采用人工配制的培养基,在无菌及人工控制的条件下进行快速繁殖的一种现代生物技术[2,3]。此项技术能够采用工业化管理手段,迅速批量生产优质苗木,为实现难生根树种快繁提供技术支撑。

本试验对白城山新1号杨增殖培养基配方进行研究,解决了其苗木扩繁难的问题。通过调整对组培苗增殖及生长发育有显著影响的培养基组分含量、激素种类和质量浓度,使培养基更适合组培苗的生长,达到增殖更快、质量更好的目标。

1 材料与方法

1.1 材料

对白城山新1号杨1年生枝条进行初代培养,将筛选出的初代无菌芽苗作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

采用正交试验方法,以MS培养基为基础配方,选择与组培苗增殖密切相关的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤(6-BA)、生长素萘乙酸(NAA)、用大量元素(KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O)配成MS基本培养基配方20倍浓度的母液、优质食用蔗糖,其质量浓度(含量)分别设置5个水平(见表1),按L25(56)正交表进行试验。

表1 因素水平设计

1.2.2 增殖培养

为更好地控制污染,增殖培养采用传统组培技术体系。培养瓶采用带有透气膜盖耐高温塑料广口瓶,灌装培养基后经过高压蒸汽灭菌,在超净工作台下无菌接种,密闭培养。

1.2.2.1 培养基配制

按配方将组分分成大量元素、微量元素、有机附加物、铁盐、钙、生长调节剂等部分,将各部分分别配制成母液。大量元素配制成优化配方的20倍母液,微量元素、有机附加物、铁盐、钙分别配制成200倍母液,生长调节剂配制成1 000 mg·L-1母液,低温储存备用。配制培养基时分别量取母液加入灌装料桶,加入蔗糖和固化剂琼脂粉定容混匀。琼脂浓度决定培养基的硬度,不同批次的琼脂粉强度不同,新启用的琼脂粉要进行强度试验。培养基硬度以固定住芽苗不倒为标准,琼脂粉用量最少为佳。经过高压蒸汽灭菌的培养基琼脂粉用量为6～8 g·L-1。

1.2.2.2 培养基分装

为实现规模分装,自行研制了培养基灌装机。灌装机由料桶、循环泵、微控制器、灌装平台和一排灌装孔组成。由微控制器精准控制循环泵开关,实现精确灌装,培养基厚度控制在10～12 mm,300 mL广口塑料培养瓶灌装30～35 mL培养基。该灌装机采用冷灌装工作方式,循环泵通过内循环进行料液搅拌,防止料液在料桶沉淀(主要是琼脂粉)。灌装时按照每瓶灌装量调整灌装时间,将规格一致的培养瓶在组培专用塑料周转盘内摆放整齐,每盘6行7列。将塑料盘置于灌装平台上,调整周转盘及灌装孔使灌装孔对准第一排培养瓶口中央,打开灌装控制开关,灌一行推一行,完成一盘后关闭灌装控制开关,换盘。灌装后将培养瓶扣盖,准备灭菌。

1.2.2.3 培养基高压蒸汽灭菌

灭菌采用600 L功率24 kW卧式高压蒸汽灭菌锅,每锅可放置18盘计750个培养瓶,温度121 ℃,时间25～30 min。

1.2.2.4 接种

接种工作要求无菌操作,在超净工作台下进行。接种前芽苗培养瓶必须严格检查,有杂菌污染的一律淘汰。采用增殖培养和生根培养同时接种的方法进行接种,符合生根标准的健壮芽苗接种在生根培养基上进行生根培养,剩余的芽苗转接到增殖培养基上进行增殖培养。300 mL增殖培养瓶接种芽苗7～8棵。750 mL生根培养盒接种30棵芽苗。接种后移入培养架进行培养。

选择健壮芽苗(苗高大于2 cm,苗径较粗壮,叶子发育正常)接入生根培养基进行生根培养,平均培养14 d,根系即发育完成,达到出瓶炼苗的标准。

1.2.2.5 培养室培养条件控制

培养室是组培苗生长发育的场所,环境条件影响组培苗生长速度和质量。培养室温度控制在不高于25 ℃。培养架采用LED灯带补光,每排培养架配置1台功率400 W直流电源为灯带供电,定时开关控制电源,每日04:00—20:00补光16 h。每个培养室配置1台臭氧机进行日常灭菌,时控开关控制臭氧机启停,每日21:00—02:00设定开机40 min、停机20 min进行间歇灭菌。

1.3 数据分析

采用Minitab 17软件进行分析。

2 结果与分析

经过32 d的培养,第11个处理中的33瓶培养基有27瓶芽苗满瓶覆盖度接近100 %。试验结果见表2。

表2 试验结果

应用Minitab 17分析软件对数据进行方差分析和回归处理,结果见表3。可以看出,P值均小于0.05,选定的各因素对结果均有显著影响。

表3 方差分析

得出回归方程如下:

结果平均值=2.290 7-0.109 6-BA＿0.20+0.065 6-BA＿0.25+0.260 6-BA＿0.30-0.066 6-BA＿0.35-0.150 6-BA＿0.40+0.377 NAA＿0.05-0.287 NAA＿0.08-0.510 NAA＿0.11+0.049 NAA＿0.14+0.371 NAA＿0.17-0.702 6-BA×NAA＿1+0.810 6-BA×NAA＿2+0.467 6-BA×NAA＿3-0.331 6-BA×NAA＿4-0.244 6-BA×NAA＿5-0.096 大量元素＿12.50-0.976 大量元素＿25.00-0.235 大量元素＿37.50+0.314 大量元素＿50.00+0.993 大量元素＿62.50-0.298 蔗糖＿12.00+0.299 蔗糖＿16.00+0.399 蔗糖＿20.00+0.382 蔗糖＿24.00-0.783 蔗糖＿28.00。

回归方程提供了每因素各水平对结果平均值的贡献值,选择各因素系数最大的水平值(6-BA＿0.30、NAA＿0.05、大量元素＿50.00、蔗糖＿20.00)组成新配方进行实际培养验证,通过2代培养,此配方芽苗增殖倍数均超过3.2。

3 结论

白城山新1号杨以其优良的绿化性状和广泛的生态适应性,尤其是雌株不飞絮、不扬粉的环保性状,必将成为我国北方地区广受欢迎的优良城乡绿化树种。组培化育苗有效解决了白城山新1号杨扦插不易生根和苗木繁育问题,提高了苗木的扩繁效率,可促进该树种的大面积推广。经试验,最终确定MS+6-BA 0.30 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖20.00 g·L-1为白城山新1号杨组培增殖培养基优化配方。