内生菌对干旱胁迫下甘蔗的生理响应及抗旱性评价

罗艳菊 谢林艳 邹清林 李四杰 刘涵 刘鲁峰 何丽莲 李富生

（云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201）

甘蔗（Saccharum officinarumL.）是世界上重要的农作物之一，也是我国最主要的糖料作物和能源作物［1］。目前，将近有130 多个国家进行甘蔗的种植，占地约2 600 万hm2［2］。干旱严重限制着甘蔗产业的发展。我国的广西、广东、云南等甘蔗主要种植区，大部分地区是坡地，容易遭受水分亏缺的问题，严重影响着甘蔗产业的发展［3］。甘蔗是一种喜水作物，也是一种耗水作物，其生长对缺水高度敏感，缺水可导致高达60%的产量损失，在印度容易发生干旱的甘蔗覆盖面积约297 万hm2［4-5］。我国80%以上的甘蔗种植均在半干旱或干旱区，干旱频繁发生，造成的损失尤为严重［6］。随着全球气候变暖，未来干旱灾害可能会更加频繁和严重，中国南方原本湿润的地区可能将面临干旱的趋势。甘蔗生长期内短期干旱的风险正在增加，未来甘蔗干旱面积将逐渐增加，可能导致目前高适宜甘蔗种植区达到耐旱极限［7］。

在自然界中，植物与微生物可以形成有益的关系，这些微生物可以促进植物生长并适应环境胁迫［8］。内生菌普遍存在于几乎所有植物中，能赋予植物多种抗性和进化策略［9］。因此，明确内生菌对甘蔗抗旱性的生理响应对甘蔗内生菌的开发利用及甘蔗旱地抗旱栽培技术的推广具有重要意义。张文英等［10］发现干旱胁迫下，接种印度梨形孢菌增强了玉米的抗旱性；Morales‑Quintana 等［11］也表明干旱胁迫下接种内生菌提高了水分限制条件下草莓的存活率。此外，由于存在当地微生物群，且自然栖息地是非无菌环境，多种内生菌联合接种比单一接种更能模拟自然条件，并且被认为在非无菌的自然环境中更具竞争力和有效性［9］，而且有研究表明联合接种内生菌比单独接种效果更佳［12］。因此，有必要研究在非无菌的干旱胁迫下不同内生菌组合接种的协同效应，确定宿主植物和内生菌之间的有利组合。

利用内生有益真菌改善宿主的耐旱性已在多种作物中被报道［10,13］，而对于利用内生细菌缓解甘蔗干旱胁迫的研究却鲜有报道［14］。

本研究拟在探究接种内生细菌对干旱胁迫下甘蔗生理影响的基础上，揭示内生菌株缓解甘蔗干旱胁迫的生理响应机制，为旱地蔗区的栽培和甘蔗的增产增收提供新的途径和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗材料‘新台糖22’（‘ROC22’）取自云南农业大学甘蔗研究所资源圃。

1.1.2 菌株材料 前期云南农业大学甘蔗研究所筛选并保存的体外耐旱性较强的4 株甘蔗内生菌株K5、ZM、D58、TY93（ 其中，K5、ZM、YT93、D58 均为甘蔗内生菌的代号名称）。经16S rDNA 测序鉴定，其中，K5 为考克氏菌（Kocuriasp），登录号为OP737815；ZM、D58 和YT93 均为芽孢杆菌（Bacillussp.），登录号分别为OP740361、OP984326和OP738299。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验在云南农业大学试验基地的大棚内进行。选择‘新台糖22’作为试验材料，催芽2 周后选择大小均匀的芽进行种植，种植的塑料盆规格为28 cm×30 cm，每盆种植1 个单芽，种植后清水正常浇灌，10 d 后进行菌株菌悬液浇灌处理，菌悬液浓度为1×107CFU/mL，之后每隔2 周进行一次菌株菌悬液浇灌，甘蔗生长到2 个月左右的苗期进行干旱胁迫处理。其中正常供水的土壤含水量保持在25%-30%；中度胁迫的土壤含水量为10%-12.5%［15］；各处理停止浇水9 d 后达到中度干旱，第10 天上午进行叶片取样，胁迫开始期间每天19:00采用土壤水分温度测定仪测定土壤含水量。胁迫完成取样后进行复水处理（土壤含水量保持在25%-30%），复水4 d 后取样。

盆栽分别设置8 个处理，每个处理6 个重复，共48 盆。8 个处理分别为：（1）对照：非干旱+清水浇灌（CK）；（2）干旱+清水浇灌（WD）；（3）干旱+内生菌K5 菌悬液浇灌（KD）；（4）干旱+内生菌ZM 菌悬液浇灌（ZD）；（5）干旱+内生菌YT93 菌悬液浇灌（YD）；（6）干旱+内生菌D58菌悬液浇灌（DD）；（7）干旱+内生菌ZM、YT93、D58 组合菌悬液浇灌（TD）；（8）干旱+内生菌K5、ZM、YT93、D58 组合菌悬液浇灌（FD）。

1.2.2 测定指标与测定方法 取甘蔗植株+1 叶，擦净表面污渍后，液氮速冻，‑80℃保存备用。使用苏州格锐思生物科技有限公司生产的超氧化物歧化酶试剂盒、过氧化物酶试剂盒、丙二醛试剂盒、脯氨酸试剂盒、叶绿素试剂盒、可溶性糖试剂盒，分别测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）的活性及丙二醛（malondialdehyde, MDA）、脯氨酸（proline, Pro）、叶绿素（chlorophyll, ChI）、可溶性糖（soluble sugar,SS）的含量，并采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白（soluble protein, SP）的含量。

1.2.3 抗旱性综合评价 首先对干旱胁迫下7 个处理的9 个生理指标进行相关性分析，对比各指标间的相关性，随后采用主成分分析的方法对各指标进行降维处理，筛选出抗旱性综合指标，最后采用隶属函数法对其进行抗旱性综合评价［16-18］。

1.2.3.1 隶属函数值

公式中：Ui为隶属函数值，PCmin为7 个处理中第i 个主因子得分最小值；PCmax为7 个处理的第i个主因子得分最大值。

1.2.3.2 主因子权重

公式中：Pi为主成分分析后所得的第i 个综合指标的贡献率。

1.2.3.3 抗旱性综合评价值

1.2.4 灰色关联度分析 选择抗旱性综合评价值（D值）为参考序列X0，各指标为比较序列，记作Xi（i=1，2…7）。

1.2.4.1 变量数据无纲量化处理 对各变量的数据进行无纲量化处理，此处利用公式（4）均值化的方法进行数据处理：

公式中：x'j为标准化后的数据，为各指标变量的平均值，Sj为各指标变量的标准差。

1.2.4.2 差序列、关联系数和关联度计算差序列：

并求出差序列的最小绝对差值和最大绝对差值，代入公式（6）计算关联系数，最后计算各指标与D值的关联度［17,19］。

1.2.5 数据处理 采用Excel 2019、SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析、相关性分析、主成分分析、隶属函数分析和灰色关联度分析，使用GraphPad Prism8.0.2 软件进行绘图。

2 结果

2.1 干旱胁迫下接种内生菌对甘蔗苗期叶片相对含水量和离体失水率的影响

与CK 相比较，干旱胁迫下各处理甘蔗植株苗期的叶片相对含水量（RWC）降低，其中，WD 降低的程度显著低于其他处理，复水后，除了WD 处理的叶片相对含水量恢复得较慢，其他处理的叶片相对含水量均恢复到与CK 相近的水平（图1‑A）。各处理的离体失水率（RWL）均显著低于CK，干旱胁迫处理中WD 处理的离体失水率最低，且复水后各处理的RWL 也显著低于CK（图1‑B）。

图1 干旱和复水对各处理甘蔗苗期叶片相对含水量和离体失水率的影响Fig. 1 Effects of drought and rehydration on the relative water contents and in vitro water loss of sugarcane leaves at seedling stage

2.2 干旱胁迫下接种内生菌对甘蔗苗期叶片渗透物质的影响

相比于CK，干旱胁迫使甘蔗植株叶片中的Pro含量迅速增加，各处理中，ZD 和KD 处理的Pro 增加效果较为显著，复水4 d 后又迅速减少，但还是显著高于CK（图2‑A）。干旱胁迫下KD、DD、FD处理的SS 含量显著增多，各处理在复水4 d 后SS含量又迅速降低，除YD、FD 处理外，其他处理在复水后的SS 含量与CK 的含量相近（图2‑B）。干旱胁迫使甘蔗叶片中的SP 含量升高，其中接种内生菌的处理，其SP 的含量显著高于未接菌的处理，复水后叶片中的SP 含量又逐渐降低，但降低的速度较慢（图2‑C）。此外，干旱也使得甘蔗植株叶片中的MDA 含量显著增加，并且WD 处理的MDA 含量显著高于其他处理（图2‑D）。

图2 干旱和复水对各处理甘蔗苗期叶片Pro、SS、SP 和MDA 的影响Fig. 2 Effects of drought and rehydration on the Pro, SS, SP and MDA contents of sugarcane leaves at seedling stage

2.3 干旱胁迫下接种内生菌对甘蔗苗期叶片抗氧化酶活性的影响

干旱胁迫下甘蔗叶片中SOD 和POD 含量迅速增加，ZD、TD 处理的SOD 含量显著高于其他处理，复水后又逐渐减少，但还是显著高于CK（图3‑A）。KD 处理POD 含量显著高于其他处理，复水后含量又逐渐减少，且各处理干旱胁迫复水后POD 减少速度低于SOD 减少的速度（图3‑B）。

图3 干旱和复水对各处理甘蔗苗期叶片抗氧化酶活性的影响Fig. 3 Effects of drought and rehydration on the antioxidant oxidase activities of sugarcane leaves at seedling stage

2.4 干旱胁迫下接种内生菌对甘蔗苗期叶绿素的影响

干旱胁迫使得甘蔗植株叶片的叶绿素总含量显著降低，而接种内生菌的各处理均不同程度地提高了甘蔗植株叶片中叶绿素总量和叶绿素a/b 的比例，其中ZD 处理的效果最佳，其叶绿素含量甚至高于CK 处理；而复水后各处理的叶绿素a/b 均出现上升的现象（表1）。

表1 干旱和复水对各处理甘蔗苗期叶绿素的影响Table 1 Effects of drought and rehydration on chlorophyll at seedling stage of sugarcane（mg·g-1）

2.5 主成分分析

首先对干旱胁迫下7 个处理的9 个生理指标进行相关性分析，可知有4 对指标呈显著相关（P<0.05）；其中RWC 与MDA 呈显著负相关，与SP呈显著正相关；而RWL 与SP 呈显著正相关，Pro与ChI 也呈显著正相关，其中Pro 与Chl 的相关性系数最大R2=0.848（表2）。

表2 各指标的相关性分析Table 2 Correlation analysis of each index

由指标间的相关性分析可知，各指标间存在不同程度的相关性，所以对干旱胁迫下7 个处理的9个指标进行主成分分析。将特征值≥1，且累积贡献率大于80%作为判别条件，共提取到3 个主成分，将9 个抗旱性指标转化为3 个独立的综合指标进行抗旱性综合评价。其中，主成分1（PC1）的特征值为3.816，贡献率为42.402%，主成分2（PC2）的特征值为2.658，贡献率为29.533%，主成分3（PC3）的特征值为1.391，贡献率为15.452%。前3 个主成分的累积贡献率为87.388%，具有较好的代表性，与甘蔗苗期的抗旱性具有直接的关系，可作为7 个处理间抗旱能力评价的综合指标。主成分1 中系数较大的有RWC（0.248）、SP（0.239）；主成分2 中系数较大的有Pro（0.293）和ChI（0.297）；主成分3 中系数较大的有SS（0.635）和ChI（0.302）（表3）。

表3 综合指标系数及贡献率Table 3 Comprehensive index coefficient and contribution rate

2.6 抗旱性综合评价

采用隶属函数法对各指标进行综合性评价，根据1.2.3.1 中公式（1）计算各处理在3 个主成分中的隶属函数值。综合指标主成分1 中，YD 处理的隶属函数值最大U1=1.000，WD 处理的最小U1=0.000；综合指标主成分2 中，ZD 处理隶属函数值U2=1.000最大，FD 处理的隶属函数值最小U2=0.000；综合指标主成分3 中，KD 处理隶属函数值U3=1.000 最大，TD 处理的隶属函数值最小U3=0.000。根据1.2.3.2的公式（2）计算各成分的权重，分别为0.485、0.338、0.177；最后根据1.2.3.3 的公式（3）计算干旱胁迫下7 个处理的抗旱性综合评价值（D值），D值越大说明其抗旱性越强，7 个处理的抗旱性按照D值的大小进行排序为：ZD ＞DD ＞KD ＞TD ＞FD ＞YD ＞WD（表4）。

表4 处理的综合指标值、权重、隶属函数值（Ui）、D 值及综合评价Table 4 Comprehensive index value, weight, membership function value（Ui）, D value and comprehensive evaluation of each processing

2.7 聚类分析

采用组间联接法和欧氏距离对7 个干旱胁迫下的抗旱性综合评价值D值进行系统聚类分析，在欧氏距离为5 处将7 个处理分为3 个类群。其中第1个类群包括：YD、FD、TD、KD、DD，对应抗旱性为中，第2 个类群为ZD，对应抗旱性为强，第3 个类群为WD 处，对应抗旱性为弱（图4）。

图4 聚类分析结果Fig. 4 Cluster analysis results

2.8 关联性分析

利用1.2.4.1 的公式（4）将各变量的数据进行无量纲化处理（表5）。灰色关联度分析是分析各指标与抗旱性之间的密切程度，根据1.2.4.2 的公式（5、6 和7）计算差序列、关联系数和关联度。通过灰色关联度分析可知，各指标与抗旱性的关联顺序为SOD ＞ChI ＞RWC ＞Pro ＞SP ＞POD ＞RWL ＞MDA ＞SS。说明SOD、ChI、RWC、Pro 对各处理的抗旱性关联度较大，是衡量干旱胁迫下7 个处理抗旱性的首要指标（表6）。

表5 数据的无量纲化处理Table 5 Non-dimensional processing of data

表6 干旱处理的抗旱性综合评价值与各指标的关联系数、关联度和关联序Table 6 Correlation coefficient, correlation degree and correlation order of the comprehensive evaluation values and each index of drought resistance under drought treatment

3 讨论

苗期是对水分较为敏感且需水量较多的一个时期，植物苗期受水分胁迫较严重时可能导致植株死亡［20］。云南省多发生季节性干旱，直接危害甘蔗的萌发与幼苗生长，进而影响甘蔗的产量和品质，所以提高甘蔗苗期的抗旱具有重要的意义。植物在干旱胁迫下会在体内发生一系列的生理反应来保护自身免受损害。遇到干旱胁迫时，植物体内的Pro、SP、SS 等一些渗透物质的含量及抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性与植物的抗旱性呈正相关［21］。国内外学者已筛选出许多与甘蔗抗旱性有关的指标［18］，但甘蔗抗旱性鉴定指标的筛选目前尚未形成统一的评价标准［22］。本研究表明SOD、ChI、RWC、Pro 等指标与抗旱性综合评价值D值的关联度较高，是有效衡量各处理抗旱性强弱的首选指标。谭秦亮等［23］表明甘蔗叶片的抗氧化酶活性和渗透物质含量可作为甘蔗抗旱性鉴定和评价的重要指标，刘硕等［24］也表明叶绿素含量可以作为甘蔗抗旱性评价的重要指标，与本研究结果具有一致性。方自豪［18］研究表明甘蔗干物质重量和株高等生长参数及光合参数，可以作为甘蔗苗期抗旱性评价的有效指标，而抗氧化酶与渗透物质与甘蔗的抗旱性关联较弱，与本研究结果具有一定的差异性。

许多研究均表明接种内生菌能提高植物的抗旱性［14,25-26］。本研究对不同甘蔗内生菌进行了组合接种，探究内生菌单一接种和组合接种对甘蔗抗旱能力的影响，试验结果表明，接种内生菌能不同程度地提高‘ROC22’甘蔗苗期的抗旱性，但不是接种内生菌的数量和种类越多，其提高甘蔗抗旱性的效果越好。本研究结果显示，3 株和4 株内生菌组合接种的处理（TD、FD）提高甘蔗抗旱性的效果反而没有单一接种（ZD、DD 和KD）的效果好，但又比单一接种的YD 处理好。Zuo 等［9］也表明无论是单一接种还是组合接种，其提高植物抗旱性的效果主要取决于菌株的种类和不同组合，与本研究结果具有一致性。

本研究中接种ZM 内生菌的ZD 处理显著提高了甘蔗苗期的抗旱性，且决定抗旱性有效的首选指标为SOD、ChI、RWC、Pro，说明ZM 菌株通过提高甘蔗苗期的Pro、RWC、ChI 的含量和SOD 酶活性来提高甘蔗苗期的抗旱性。Morales‑Quintana等［11］发现接种内生真菌提高了草莓植株的光合效率、抗氧化酶活性和Pro 含量，并降低了MDA 含量。Scudeletti 等［13］也表明接种木霉菌的甘蔗植株，通过增加SOD、POD 活性以及Pro 浓度来缓解干旱胁迫对其生长的影响。Wu 等［27］发现在干旱下，内生菌接种显著增加了植株叶片蔗糖、葡萄糖和果糖的浓度以及Pro 的含量，从而增强了三叶橙的抗旱性。此外，Wang 等［26］表明接种内生链霉菌属，通过提高甘蔗ChI、Pro、植物激素含量及抗氧化酶活性等一系列变化改善了甘蔗植株的抗旱性，这与本研究结果具有一致性。本研究的结果可为后期内生菌提高甘蔗抗旱性的研究提供一定的科学依据。但因甘蔗植株在盆栽试验与大田试验的生长条件具有较大的差异，且外界气候环境和土壤环境的复杂性及差异性，本研究的试验效果还有待于进一步在大田试验中进行验证。

作物的抗旱性是受多因素影响和多基因控制的数量性状，单一的指标不能代表其抗旱性的强弱，要综合多指标才能准确客观地对其抗旱性进行评价［18］。近年来，许多学者经常利用相关性分析法、主成分分析法、隶属函数分析法、聚类分析法、灰色关联度、干旱划级法等分析方法对作物的抗旱性进行分析，且在多种作物中进行应用［22,28］。李小玉等［19］用主成和灰色关联度分析对油菜耐旱性进行综合评价，方自豪［18］也通过主成分分析法、加权隶属函数分析法、聚类分析法和灰色关联度分析相结合的方法对中蔗品种（系）进行抗旱性综合性分析。本研究对干旱胁迫下7 个处理的9 个指标进行相关性分析，比较各指标间的相关性，并采用主成分分析的方法将9 个指标进行降维处理转化为3 个综合指标，随后利用隶属函数法得出抗旱性的综合评价值D值，对干旱胁迫下7 个处理的抗旱性进行综合评价。最后采用聚类分析的方法对各处理的抗旱能力进行分类，并利用灰色关联度分析，明确了7 个处理中衡量其抗旱性的首选指标。本研究既考虑了综合指标分析，消除了单一指标带来的片面性，又考虑了单一指标的重要性，最后还明确了衡量抗旱性的首选指标，较单一指标和单一方法，提高了分析结果的准确性、可靠性和全面性。

4 结论

干旱胁迫下，与不接种内生菌的处理（WD）相比，接种内生菌能够不同程度地缓解干旱胁迫，其中ZM 菌株单独接种处理（ZD）的抗旱性综合评价值D值最高，说明ZM 菌株接种处理缓解干旱胁迫的效果最佳。通过灰色关联性分析表明，SOD、ChI、RWC、Pro 与各处理的抗旱性综合评价值D值密切相关。因此，接种内生菌ZM 可以通过提高SOD 酶活性，增加ChI、RWC、Pro 的含量来缓解干旱胁迫，增强甘蔗苗期抗旱性。