52 个马铃薯遗传多样性分析及SSR 分子身份证构建

安苗 王彤彤 付逸婷 夏俊俊 彭锁堂，2 段永红

（1. 山西农业大学农学院,晋中 030600；2. 山西蓬勃农业科技股份有限公司,大同 037000）

马铃薯（Solanum tuberosumL.）是世界四大主要粮食作物之一，在全世界约162 个国家和地区均有种植。马铃薯富含丰富的营养成分，包括多种维生素及钙、钾等微量元素，且容易被消化，功能齐全，被称赞为“第二面包”。中国是世界上最大的马铃薯生产国［1-2］，至今为止，种植历史约为400 多年，新中国成立以来至2017 年，我国育成马铃薯品种622 个，其中国家审定约65 个，明显落后马铃薯育种先进国家［3］。此外，我国育成的马铃薯品种亲缘关系近，表现出较相似的形态特征，难以通过形态标记准确鉴别。在当前马铃薯生产中，存在“同名异品种”“同品种异名”的现象，因此，如何对马铃薯种质资源进行精确、快速的鉴别，并选择优良的杂交组合来培育新品种，是亟需解决的难题［4］。

近年来，随着生物技术的发展，DNA 分子标记技术的诞生给作物遗传育种带来了新的机遇［5-6］。分子标记技术具有检测手段简便、扩增结果稳定、多态性丰富及快速高效等优点，克服了环境及不同生长阶段差异的影响，能够有效提高育种效率［7-8］。其中SSR 分子标记（simple sequence repeats，简单重复序列）作为第二代标记技术，具有共显性、位点特异性和可重复性高等特点，被国际植物新品种保护联合会（UPOV）认定为鉴定植物品种的最强手段［9］。SSR 分子标记已经成功应用于花生（Arachis hypogaeaL.）［10］、黄瓜（Cucumis sativusL.）［11］和甜瓜（Cucumis meloL.）［12］等植物的纯合子鉴定和单倍体鉴定。Tiwari 等［13］使用14 个SSR 引物分析野生马铃薯物种的等位基因变异，检测到82 个多态性SSR 标记。de Haan 等［14］利用15 对SSR 引物对900多份秘鲁地方品种和100 多个外来种质进行比较，检测到173 个等位位点，其中2 个群体共有129 个等位位点，占总数的74.60%。Sharma 等［15］采用SRAP、SNP 标记，并结合SSR DNA 分子标记技术，对40 多个马铃薯品种进行多态性分析，结果显示3种标记均可区分40 多个品种。段艳凤［16］、王鹏等［17］、王若秋等［2］、高玉坤等［18］对马铃薯品种（系）的遗传多样性进行了SSR 标记分析，并构建了相应马铃薯品种（系）的DNA 分子身份证。刘春雷［19］利用EST‑SSR 引物分析了44 份马铃薯品种资源的亲缘关系，并构建指纹图谱。山西是我国马铃薯的主产区，晋北地区是山西马铃薯的主要种植地，引进、筛选不同的马铃薯品种（系），助力当地马铃薯产业的发展，但对其遗传背景不明晰，影响了马铃薯新品种选育的进程。

为明确山西主要种植及推广的马铃薯品种（系）的亲缘关系，对其遗传多样性进行评价，明晰其遗传背景。本研究采用SSR 分子标记，分析52 份马铃薯种质（系）间的DNA 水平的遗传差异，明确其亲缘关系的远近，并筛选特异性引物构建马铃薯的分子身份证，为马铃薯种质资源的亲缘关系分析、分类鉴定以及育种材料的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选用52 个马铃薯品种（系），均由山西蓬勃农业科技股份有限公司生产，材料信息见表1，于2022 年6 月1 日种植在山西省大同市左云县北十里村马铃薯脱毒种薯示范基地（112°34' E, 39°44' N），海拔1 295 m，无霜期125 d。马铃薯以高垄种植的方式播种，株距45 cm，行距60 cm。

表1 供试马铃薯品种（系）Table 1 Potato varieties（line）in the research

1.2 方法

1.2.1 马铃薯基因组DNA 提取 摘取马铃薯幼嫩叶片，用改良的CTAB 法提取基因组DNA［20］，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量，使用核酸蛋白检测仪测定DNA 浓度，之后将样品DNA 稀释为50ng/μL，置于‑20℃冰箱保存，备用。

1.2.2 马铃薯SSR 标记分析 本试验选用25 对SSR引物，来源于相关文献［8,21-26］使用的引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，其引物序列见表2。

表2 SSR 引物名称和序列Table 2 SSR primers name and sequences

SSR‑PCR 扩增体系：体系总容量为10 μL，含1 μL 样品DNA（50 ng/μL），5 μL Mix，上游和下游引物各1 μL，ddH2O 2 μL。

扩增程序： 94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，5 个循环；95℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸90 s，72℃延伸10 min，35 个循环；4℃反应终止，自动保存。以50 bp DNA Ladder Marker 作为分子量标记，产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，恒压170 V，电泳2 h，用银染法显色后，放在凝胶观察灯上进行观察并拍照记录［27］。

1.2.3 数据分析 电泳结束后采取人工读带方式，按照“0/1”赋值法进行SSR 多态性条带统计，在扩增位点中，清晰可见、可重复的条带用“1”表示，在同一位点上，缺失或弱带标记为“0”。根据基因组DNA 片段大小依次记录，将数据输入Excel 2010软件构建“0、1”二进制模型。计算各引物扩增的总条带数、多态性条带数。

通过PIC 值（polymorphism information content）对引物多态性进行评估。计算公式为：PICi＝1-∑Pij2，Pij表示标记i 的第j 个等位基因的频率［28］。

利用POPGENE version 1.31 软件计算观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei's 遗传多样性指数（H）、Shannon's 信息指数（I）；利用NTSYS pc version 2.00e 软件，通过Qualitiative data模块计算参试材料间的遗传相似系数，SASYS 模块以非加权配对算术平均法（UPGMA）对品种（系）进行聚类分析［29-30］，Tree plot 模块绘制树状聚类图，根据不同SSR 标记对条带的结果依次排序，采用二维码技术（https：//cli.im/）将材料基本信息（包括名称、统一编号、来源地、字符串DNA）转化为可扫描的二维码，即二维码DNA 分子身份证。

2 结果

2.1 马铃薯SSR引物多态性分析

本试验前期从25 对SSR 引物中筛选出16 对具有较高多态性且条带清晰的引物，多态引物比率为64.54%。16 对多态性SSR 引物共检测到217 个等位位点，平均每对引物检测位点13.56 个，引物C59 检测出的位点数最高为26 个，引物C3 检测到的位点最低为4 个；多态位点百分数介于28.57%-100.00%之间，均值是64.71%，引物C59 检测到的多态位点最高为100.00%，引物STM1016 最低为28.57%；观测等位基因数（Na）介于1.50-2.00 之间，平均数为1.96；有效等位基因数为（Ne）介于1.07-1.38，平均为1.21；Nei's 遗传多样性指数（H）介于0.06-0.24，平均为0.14；Shannon's（I）在0.13-0.39之间，平均为0.24。多态性引物检测位点信息见表3，引物C59 对马铃薯品种（系）的扩增结果见图1。引物多态性信息含量（PIC）介于0.02-0.30，平均为0.15。其中，引物C3 的PIC值最高，S151 的PIC值最低。16 对引物中有1 对引物为中度多态位点（0.25 ≤PIC≤0.50）［31］。

图1 引物C59 对马铃薯基因组DNA 的扩增结果Fig. 1 Amplification results of genomic DNA of potato with primer C59

表3 SSR 引物扩增结果Table 3 Amplification results of polymorphic SSR primers

2.2 SSR引物多态性参数相关分析

由表4 可得，有效等位基因数（Ne）与Nei's遗传多样性指数（H）、Shannon's 信息指数（I）均呈极显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.961、0.903；Nei's 遗传多样性指数（H）与Shannon's 信息指数（I）也呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.982；引物的多态性信息含量（PIC）与观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei's遗传多样性指数（H）、Shannon's 信息指数（I）均呈显著正相关（P<0.05），相关系数依次为：0.571、0.558、0.586、0.542。表明有效等位基因数（Ne）、引物的多态性信息含量（PIC）可以作为评价不同品种（系）马铃薯遗传多样性的参数。

表4 各参数的相关性分析Table 4 Correlation analysis of each parameter

2.3 马铃薯亲缘关系聚类分析

经分析，52 个马铃薯品种（系）间遗传相似系数范围是0.01-0.91，变幅为0.89。其中‘东农310’和‘克新25’、‘陇薯20 号’和‘北方016’的遗传相似系数最高，为0.91，表明两者的遗传距离最小；‘北方016’和‘石薯1 号’、‘北方016’和‘石薯3 号’遗传相似系数最低，均为0.01，说明他们之间的遗传距离最大。聚类分析得到52 份供试材料间的遗传关系（图2）。

图2 基于SSR 标记的52 份马铃薯品种（系）聚类图Fig. 2 Clustering diagram of 52 potato varieties（lines）based on SSR marker

在遗传相似系数为0.23 处，可将52 份品种（系）分为3 大类。类群I 所含的材料最多，包括49 个品种（系），其中，46 个是北方品种（系），3 个是国外引进品种（系）；类群II 包括2 个品种，‘北方016’和‘晋薯16 号’，其特点是干物质含量高、薯皮黄色；类群III 仅包括‘晋薯15 号’。在遗传相似系数0.36 处，类群I 又可以分为7 个亚类。第1 亚类含有21 个品种（系），均为抗性较强的品种（系），其中包括‘民丰红’‘雪川红’‘黑金刚’‘紫玫瑰’，均为彩色马铃薯，‘V7’‘荷兰806’为国外引进品种，‘蓬勃2 号’‘蓬勃1 号’‘大同里外黄’为地理来源相同的品种，‘青薯10 号’和‘V9’由青海省农林科学院选育而成。第2 亚类含有1 个品种‘石薯3 号’；第3 亚类包括‘中加2 号’与‘紫玫瑰’，均为中晚熟品种，抗病性强；第4 亚类也含有2 个品种为‘丽薯6 号’‘冀张薯12 号’，薯皮薯肉均为白皮白肉，中晚熟品种；第5 亚类有17 个品种（系），其中‘陇薯’系列的3 个材料（‘陇薯7 号’‘陇薯10 号’‘陇薯20 号’）、‘京张薯’系列的2 个材料（‘京张薯1号’‘京张薯3 号’）、‘中薯’系列的2 个材料（‘中薯306’‘中薯9 号’）、‘冀张薯’系列的2 个材料（‘冀张薯8 号’‘228’）、本溪市的2 个材料（‘476’‘石薯6 号’），根据地理来源划分在一个亚类；第6 亚类含有‘陇薯14 号’和‘青薯9 号’，其薯型均为椭圆形、浅芽眼；第7 亚类包括‘克新13’‘荷兰13’‘冀张薯12 号’，花冠均淡紫色。

2.4 不同品种（系）马铃薯指纹图谱构建

采用16 对多态性引物对52 个马铃薯品种（系）进行DNA 指纹图谱分析，引物C33、S25、S151 对马铃薯品种（系）的PCR 扩增结果的电泳条带见图3。在所选的16 对多态性引物中任何一对引物都只能区分部分品种。对16 对多态性SSR 引物的扩增谱带进行统计分析，综合考虑引物的SSR 多态条带比率（PPB）、PIC值大小和条带统计的难易程度，筛选出引物C59、C33、S25 和S151，共4 对引物可构建52 个品种（系）的指纹图谱。C59 扩增出的条带大小分别为180、170 和160 bp（图1）；S25 扩增出的条带大小分别为180、170、160 和150 bp（图3‑A）；C33 扩增出的条带大小分别为170、160、155和150 bp（图3‑B）；S151 扩增出的条带大小分别为120、110、100、90 和85 bp（图3‑C）。利用4 对引物可以将马铃薯品种（系）正确区分，将每份材料对应的扩增结果转化为二进制“0/1”代码，得到每个品系独立的唯一编码，构成52 份马铃薯材料的“数字化指纹图谱”（表5）。

2.5 马铃薯品种（系）的分子身份证

使用在线二维码生成器展示52 个品种的实验结果，图4 中每个QR 编码图对应一个品种，编码的信息包括指纹图谱及SSR 电泳标记等信息，在生产中，可用于日常的品种鉴别和亲本选择，极大地提高生产效率，方便查看各品种的遗传信息。

3 讨论

3.1 马铃薯种质资源的遗传多样性

通过对种质资源进行亲缘关系分析、遗传多样性评价，能够了解种质资源的变异水平、遗传结构和背景，可为种质资源的开发、利用以及创新提供研究基础［31］。本研究利用SSR 标记分析马铃薯种质资源的遗传多样性，16 对多态性引物共扩增出217个条带，平均多态性位点百分率达64.71%，此结果低于张招娟等［32］的研究结果（96.60%），与高玉坤等［18］的研究结果（65.77%）相近。平均多态性百分率的高低可能与研究材料、选用引物及选用引物的数量相关。

3.2 马铃薯种质资源的聚类分析

本研究利用NTSYS pc version2.00e 软件进行聚类分析，将52 份马铃薯种质资源划分为3 个类群。其中类群I 最大，包含49 个品种（系），占总研究材料的94.23%，其中，46 个是北方品种（系），3 个是国外引进品种（系）为‘V9’‘V7’‘荷兰806’，均适宜晋北地区种植。46 个北方品种（系）未与类群II、类群III 聚为一类，即大类的划分上未按照地理来源进行聚类。但类群I 中的第5 亚类‘陇薯’系列、‘冀张薯’系列、‘石薯’系列、‘中薯’系列的研究材料，按照地理来源进行聚类被划分在同一类群。张海雯等［9］采用SSR 标记对62 份马铃薯材料进行遗传多样性研究发现，来源地相同的品种大多聚类为一个分支或距离较近的两组中，与本研究结果一致。同时发现，由相同育种单位山西农业大学高寒区作物研究所选育的‘晋薯16 号’与‘晋薯15 号’并没有聚为一类，‘晋薯16’以‘NL94014’作母本，用‘9333‑11’为父本配置杂交组合，通过有性杂交选育而成，‘晋薯15’以母本‘9341‑14’与父本‘9324‑2’杂交后定向选育，二者所采用的骨干亲本材料有差异，选育品种的目标性状不同，因而亲缘关系较远，未聚为一类。可能也与本研究中SSR 标记引物不多，检测位点有限有关。

3.3 马铃薯种质资源SSR分子身份证的构建

随着马铃薯主粮化进程的推进，马铃薯育种品种逐年增加，导致一些品种混淆，出现“同名异物”“同物异名”的现象。在分子标记的基础上利用二维码技术生成品种的分子身份证［33-34］，可有效地解决马铃薯鉴定的难题，有利于马铃薯种质资源的鉴定以及溯源，有利于保护相关的知识产权。近年来，茶树［Camellia sinensis（L.）O. Kuntze.］［35］、苹果（Malus pumilaMill.）［36］、 大豆［Glycine max（L.）Merr.］［37］、小麦（Triticum aestivumL.）［38］等作物都在SSR 分子标记的基础上，构建了分子身份证。本研究中任何一对引物均无法区分52 个马铃薯品种（系），根据PIC值以及条带统计的难易程度，逐一加入引物对，对材料进行比较鉴定，直到把52 个供试材料区分开为止。依据利用尽量少的引物来区分品种原则，选择了C59、C33、S25、S151 共4 对引物构建了52 个马铃薯品种（系）的数字化指纹图谱。管俊娇等［39］也运用了SSR 标记技术对22 对引物所形成的电泳图谱进行分析发现，4 对引物的扩增结果组合起来能将22 份青花菜种质资源区分开。刘文林等［40］也运用了SSR 标记技术对23 对引物所形成的电泳图谱进行分析，构建了63 份马铃薯种质资源的分子身份证。程林涛等［41］同样运用此方法构建了80 份草地早熟禾种质的字符串、二维码和二维码分子身份证。本研究选用4 对多态性SSR 引物构建了52 个马铃薯品种（系）的数字化指纹图谱以及对应的分子身份证，可用于马铃薯种质资源的鉴定与溯源。

4 结论

本研究从25 对SSR 引物中筛选出多态性丰富、稳定性好的16 对引物，并对52 份马铃薯品种（系）进行SSR 扩增分析，共检测到147 个多态性条带，引物平均多态条带比率为64.71%。基于最少引物鉴定最多种质的原则。利用C59、S25、C33、S151 共4 对引物组合，构建了52 个马铃薯品种（系）的数字化指纹图谱以及分子身份证，可用于马铃薯种质资源的鉴定与溯源。