活体脑部神经递质检测技术的研究进展

朱铭钰崔利利陈欢侯宏卫*胡清源*

(1. 国家烟草质量监督检验中心,烟草生物学效应重点实验室,郑州 450000;2. 青岛大学,山东青岛 266071)

神经递质主要是指实现神经化学传递信号转导,促使机体完成特定生物反应的化学物质[1]。 神经递质的新陈代谢和信号传递与维持大脑的结构和功能有关,例如在大脑神经元之间传递神经信号,维持神经系统功能以及促进神经细胞的生长和修复等。 神经递质的失调会引起人体内一系列疾病的发生,如精神分裂症、帕金森氏症、阿尔茨海默症、癫痫和注意力缺陷多动障碍等[2]。 自1921 年诺贝尔生理学和医学奖获得者奥托·洛伊发现了第一个神经递质——乙酰胆碱后,截至目前,已经确定了100 多种神经递质[3-4]。 根据其化学性质,可将脑内神经递质分为四大类:第一类为胆碱类,例如乙酰胆碱(ACh)等;第二类为单胺类,例如多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)等;第三类为氨基酸类,例如谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)等;第四类为神经肽类,例如谷胱甘肽、阿片肽等。 其中,多巴胺作为最受关注的神经递质,在人体的生命活动中发挥着重要的作用,与帕金森症和阿尔茨海默症密切相关。 乙酰胆碱和5-羟色胺等神经递质也在学习、记忆和情绪中起到重要作用。

神经递质之间存在着复杂的相互作用,协同调控人类神经性疾病。 然而,由于内源性成分的干扰以及神经递质含量不断更新变化和代谢,导致一些传统的微透析法、电化学和荧光成像等检测方法很难实现神经递质释放的精准检测,神经递质高时空分辨率的可视化检测也成为神经递质检测分析的难点[5]。 近年来,研究者们为了精确检测神经递质的释放,不断地对微透析、电化学和荧光成像等方法进行改进,开发出了一系列快速、灵敏、高效、同时检测多种神经递质的检测方法,以期了解神经递质在上述疾病中的作用机理,为新药物的开发提供技术支撑[6]。 如图1 所示,本文对微透析法、电化学法以及荧光成像这三类常用的神经递质检测技术进行详细的介绍,方便研究者根据需求选择合适的研究方法。

图1 三种神经递质检测技术的汇总图Figure 1 Summary diagram of three neurotransmitter detection techniques

1 微透析法

微透析法(Microdialysis)是目前应用最广泛的采集体内神经化学物质的方法之一,常与高效液相色谱-质谱仪等设备联用[7]。 微透析法作为一种侵入性的采样技术,其对测试组织的损伤相对较小,可以在不过度干扰研究环境的情况下对脑脊液样品进行收集。 早在1966 年,Bito 等[8]就首次提出了通过透析从大脑间质液体中收集分析物的概念。 目前,微透析法已经应用于大脑疾病的研究中,对于诊断脑类疾病的潜在原因以及治疗具有很大的意义。

微透析针被设计为穿过组织的“毛细血管”,由轴、壳体、入口管和出口管四部分组成。 入口管与灌注系统相连,通过探头输送灌注液(通常是人工脑脊液或林格氏溶液),以匹配脑间质液的电解质浓度[9]。 微透析过程中一般采用较低的流速收集透析液,以减少溶质的非特异性消耗,并维持较高的相对回收率[10]。 但这也使得微透析时间分辨率降低,不利于将神经递质浓度的改变与动物特定行为联系起来[11]。 细胞外流体中的溶液和小分子通过半透膜扩散到内部透析液中,然后被收集,如图2所示。 微透析膜可以将组织结构和灌流相关的流体动力隔离开来,因此微透析探针植入后对组织损伤或流体动力学破坏相对较少[12]。

图2 微透析针结构及微透析膜工作原理Note. After the microdialysis needle is placed in the tissue to be tested, the artificial cerebrospinal fluid is pumped into the internal pipeline through the inlet tube at a certain flow rate through the syringe pump. The semi-permeable membrane enters the probe and is continuously brought out by the continuous flow of artificial cerebrospinal fluid to realize the exchange of artificial cerebrospinal fluid and cerebrospinal fluid in the brain. Green transparent circles represent Na+, K+, Ca2 + and Mg2 +, etc.. Pink triangles represent amino acids, monoamine neurotransmitters,etc. Yellow circles represent proteins, polypeptides, etc.Figure 2 Microdialysis needle structure and microdialysis membrane working principle

透析针的大小、膜的表面积、分析物扩散系数以及透析液收集的速度都会使得微透析技术受到时间和空间分辨低的限制[13]。 为了提高微透析采样技术在时间和空间上的分辨率,Ngernsutivorakul等[14]将微制造的推拉式采样针和微流控芯片相结合,通过直接进样到质谱分析所得液滴,同时测定了谷氨酰胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸和乙酰胆碱,在100 nL/min 灌注速率下产生6 s 时间分辨率。 这种推拉式采样针提供的空间分辨率约是普通微透析探针的1000 倍。

1.1 微透析法与检测器联用

现如今有多种分析技术可定量微透析样本中的神经递质含量。 如前所述,在监测脑介质中神经递质的浓度时,时间分辨率至关重要。 微透析收集完样本后可以通过液体旋转器和注射阀与高效液相色谱仪进行在线连接将不同的神经递质分离出来,然后通过质谱仪、荧光检测器或电化学检测器等对脑脊液中神经递质的含量进行分析。 透析样品也可以冷冻存储,然后在不同的时间点通过高效液相色谱仪或气相色谱仪器等进行“离线” 分析[15]。 在线微透析虽然能最大限度地降低离线微透析过程中发生的样本丢失或降解的可能性,但是在线微透析的时间分辨率不仅受样品采集所需时间的限制,还受化学分析所需时间的限制[16]。

1.1.1 微透析法与液相色谱-质谱法联用

液相色谱-质谱法是现在应用较为广泛的定量分析方法,液相色谱-质谱联用技术不仅克服了液相色谱本身定性能力差的问题,也克服了质谱法分离效率差的问题,极大地提高了分析的灵敏度。 液相色谱-质谱法与其他检测方法相比检测物质种类的范围更广,该技术以其优异的灵敏度、选择性和准确性在神经递质的检测中占据着重要地位。 但是一些神经递质对质谱的响应信号较弱,且生物透析液中基质复杂,这就需要对样品进行复杂的前处理(如衍生化等)。 Wong 等[17]将微透析法与高效液相色谱-串联质谱法相结合,利用苯甲酰氯对包括儿茶酚胺、吲哚胺以及氨基酸等在内的70 种神经相关化合物进行标记,在33 min 内完成了对70 种化合物的分离。 大多数分析化合物的检测极限低于10 nmol/L,检出限在0.02 ~ 8.00 nmol/L 的范围内,相对标准偏差小于10%。 该方法在分析大鼠脑脊液、人脑脊液和血清等微透析液时能稳定地进行监测,证明了该方法在多种生理环境和模型系统中具有广泛的实用性。 Meng 等[18]将液相色谱-串联质谱法和化学衍生化法相结合,对大鼠血清中包括神经递质、氨基酸以及生物胺等在内的42 种极性神经化学物质进行了检测,在15 min 内完成了对42 种神经化学物质的分离。 该方法的检测限在0.05 ~ 11.63 nmol/L,定量下限为0.09 ~46.50 nmol/L。

随着近几年色谱柱的不断发展,使人们在一定程度上避免了繁琐的样品前处理过程。 Fu 等[19]将体内微透析和液相色谱-串联质谱法相结合,同时测定干细胞因子中木脂素和内源性神经递质等19 种物质,定量限为0.5 ~ 20.0 ng/mL。 该方法观察和比较木脂素在正常大鼠和阿尔茨海默氏症大鼠体内的药代动力学差异以及对神经递质的影响。Becker 等[20]通过液相色谱-串联质谱法灵敏地同时定量小鼠微透析液中多巴胺、乙酰胆碱以及5-羟色胺在内的16 种神经递质,该方法检出限为0.005 ~17.100 ng/mL,定量限为0.015 ~ 50.000 ng/mL。潘凌云等[21]利用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠脑微透析样品中11 种神经递质(如乙酰胆碱、谷氨酸、甘氨酸和去甲肾上腺素等),该方法在5 min 内对11 种神经递质进行测量,检出限为0.05 ~ 2.50 nmol/L,定量限为0.125 ~ 12.500 nmol/L。 为研究健康和疾病动物模型中神经递质的变化提供了高效的检测方法。 Helmschrodt 等[22]利用液相色谱-串联质谱法对小鼠脑透析液中5 种神经递质(多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和γ-氨基丁酸)及其代谢物共11 种物质进行定量,该方法的检出限在0.005 ~ 0.750 ng/mL,定量限在0.025 ~ 2.000 ng/mL,该方法首次能够在一个样品中同时定量胆碱、乙酰胆碱和γ-氨基丁酸,以及多巴胺和5-羟色胺代谢的代谢物。

1.1.2 微透析法与液相色谱-荧光检测器联用

液相色谱-荧光检测法在一定程度上解决了液相色谱-电化学检测法的一些缺点,因其具有更高的稳定性、更高的可靠性和易操作性。 但对于一些单胺类的神经递质,不具有吸收强荧光的官能团。 因此,通常需要在柱前或柱后进行额外的衍生化步骤,来提高检测的灵敏度。 Şanlı等[23]将微透析和液相色谱-荧光检测法相结合,通过利用3-(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉甲醛对大小鼠脊髓组织中的4 种神经递质(谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸以及γ-氨基丁酸)进行衍生化,开发出了一种快速,灵敏的神经递质检测方法。 该方法样品制备步骤简单,在最佳条件下,4 种分析物在0.50 ~ 50.00 μmol/L 的浓度范围内呈线性,检测限和定量限的范围分别为0.03 ~0.06 μmol/L 和0.095 ~ 0.179 μmol/L。 邓祖跃等[24]开发了一种分离度高且稳定性好的液相色谱-荧光检测法,对大鼠不同的6 个脑区中的去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺及其代谢物共7 种物质进行定量。 该方法在0.9 ~ 400.0 μg/L 的浓度范围内线性范围良好,检测限的范围为0.3 ~ 8.0 μg/L,证实了脑内单胺类神经递质在不同脑区分布的差异。 昝富文等[25]通过高效液相色谱-荧光检测法研究小鼠随百草枯中毒时间变化脑组织中8 种神经递质(多巴胺、左旋多巴、高香草酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、二羟基苯乙酸、5-羟色胺和5-羟吲哚乙酸)的含量变化。 该方法的灵敏度高、选择性好、操作简便,检出限的范围为0.34 ~ 5.26 μg/L。

1.1.3 微透析法与液相色谱-电化学检测器联用

液相色谱-电化学检测法与液相色谱-质谱法相比,具有较高的灵敏度和选择性,操作相对比较简单。 且大多数神经递质是电活性化合物,液相色谱-电化学检测法在检测具有电活性的神经递质时不需要进行衍生化处理,这也避免了液相色谱-质谱法和液相色谱-荧光检测法在样品检测前复杂的前处理过程。 液相色谱-电化学检测法虽然具有较高的灵敏度和选择性,但与液相色谱-质谱法和液相色谱-荧光检测法相比神经递质的检测种类相对较少,加上电极变质等局限性,导致液相色谱-电化学检测法在重现性上相对较差。 van Schoors 等[26]开发了一种快速灵敏的微孔超高效液相色谱法,通过与电化学检测相结合同时测定大鼠脑微透析样品中的多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺。 该方法测得去甲肾上腺素的定量下限为100 pmol/L,多巴胺和5-羟色胺的定量下限为150 pmol/L。 徐妍等[27]将微透析技术与高效液相色谱-电化学检测技术相结合对大鼠纹状体部位脑脊液中所含的多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、高香草酸、5-羟色胺以及5-羟吲哚乙酸的含量进行测量。 该方法的线性范围为0.2~ 500.0 ng/mL,日内和日间精密度(1 d)均不大于9.7%,检出限为0.1 ~ 0.2 ng/mL。 该方法具有较高的灵敏度和良好的选择性,对于在线、动态监测药物作用下活体动物脑脊液中神经递质变化具有重要意义。 刘斌等[28]采用微透析和高效液相色谱-电化学检测器联用的方法,测定了大鼠右侧下丘脑腹外侧视前区中5-羟色胺,多巴胺以及去甲肾上腺素在1 d 内的变化趋势,实时评价朱砂安神丸引起的单胺神经递质的变化效应以及对睡眠的影响。该方法线性范围为3.125 ~ 50.000 pg/mL,日内和日间精密度均小于3.6%。 结果表明,朱砂安神丸抑制下丘脑腹外侧视前区接受5-羟色胺和去甲肾上腺素,从而起到安神助眠的作用。

1.1.4 微透析法与气相色谱-质谱法联用

另一种和微透析相结合用于测定神经递质的技术是气相色谱-质谱联用法(GC-MS)。 尽管在对神经递质的检测方面,通常首选微透析与液相色谱-质谱法相结合,但是气相色谱-质谱法在对一些神经递质的检测方面具有出色的特异性和选择性。Farthing 等[29]建立了一种快速、选择性的气相色谱-串联质谱法同时测定小鼠脑组织中γ-氨基丁酸和谷氨酸。 由于GC 需要挥发性化合物,因此在加热的GC 进样口在线对γ-氨基丁酸和谷氨酸进行衍生化,以获得挥发性更强、反应活性更低的化合物[30]。该方法在0.5 ~ 100.0 μg/mL 的范围内呈线性,γ-氨基丁酸和谷氨酸的检出限分别为250 ng/mL 和100 ng/mL。 因此,根据所使用的神经递质分离技术和检测器的不同,微透析具有不同的灵敏度和选择性,如表1 所示。

表1 与微透析联用的不同检测器之间的比较Table 1 Comparison between different detectors for use with microdialysis

2 电化学传感器法

除了微透析法外,基于氧化还原反应原理的电化学检测方法近年也逐步发展起来,如图3 所示。自1973 年Kissinger 等[31]首次使用伏安法后,伏安法已经发展成为以亚秒精度进行体内神经化学监测的唯一可行技术。 目前,包括循环伏安法(CV)、差示脉冲伏安法(DPV)和快速扫描循环伏安法(FSCV)在内的许多伏安技术已被应用到神经化学物质的测量中[32-33]。 然而CV 仅限于体外应用和检测高浓度的神经递质,且时间分辨率较低。 DPV 虽然可以用单个探针同时检测多个分析物,但仍不足以捕捉神经递质的亚秒变化。 而FSCV 能够以高时间分辨率在体内外快速检测神经递质[34]。 接下来,本文详细综述了FSCV 的基本原理、发展以及该方法在神经传递研究中的应用进展。

FSCV 常被用来测量清醒和有行为的动物大脑中的多巴胺,解决生物医学中神经递质局部浓度低、测量难的问题[35]。 FSCV 以高扫描速度将三角形波形应用于微电极,进而快速氧化和还原电极表面的电活性物质,微电极的小尺寸(直径5 ~ 20 μm)使其比微透析探针更能接近要检测的释放部位[36]。 近几年随着人们对电极的不断开发,FSCV可以与多电极阵列联用实现各种神经递质的检测。Castagnola 等[37]利用玻碳微电极阵列对大鼠纹状体中多巴胺和5-羟色胺进行定量。 该方法具有良好的稳定性和可重复性,多巴胺和5-羟色胺的检测范围为10 ~ 200 nmol/L。 然而FSCV 所使用的传统的三角形波形在检测DA 和NE 时会产生类似的伏安图,难以区分这两种分析物的变化,分子特异性较差[38]。

FSCV 主要通过对电极进行修饰或改变电流波形来提高其化学选择性。 在电极方面,电极涂层可以防止具有相似氧化还原曲线的分析物吸附到电极表面,避免电极对非特异性分子的吸附,从而提高化学选择性[39]。 例如,Nafion 涂层电极已成功用于5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的检测且防止碳纤维电极结垢,解决了5-羟色胺干扰降低记录特异性和保真度等问题[40]。 Taylor 等[41]在3,4-乙烯二氧噻吩的基础上开发出一种纳米复合涂层,使得碳纤维电极检测多巴胺的灵敏度提高了大约422 倍,检测范围为191 ~ 223 nmol/L。 Puthongkham 等[42]将纳米金刚石悬浮液滴铸到碳纤维微电极上,发现纳米金刚石能够显著提高FSCV 对神经递质检测的灵敏度,同时还能够降低碳纤维电极在电化学和生物上的污损程度。 该方法在检测多巴胺时表现尤为明显,灵敏度提高了1.9 ~ 2.3 倍,检出限提高至2 ~4 nmol/L。 而Bennet 等[43]首次将钻石电极记录应用于人类,开发出了掺硼钻石电极。 该电极的灵敏度与碳纤维电极相当,但物理强度要比碳纤维电极高出200 倍左右,在体外的使用寿命更长。 在电流波形方面,通过改变波形的电势极限、扫描速率和应用频率来提高FSCV 对神经递质检测的灵敏度、选择性和时间分辨率等各种性能,该方法性价比高、操作简单[44]。 FSCV 的标准波形是类似CV 的三角形,若使用其他形状的定制波形,可以实现特定化合物的检测[45]。 Jo 等[46]将三角形波形和矩形波形相结合,利用0.1、0.2 和0.3 V 正常脉冲伏安法和FSCV 交替进行对大鼠纹状体中的多巴胺和去甲肾上腺素进行区分,在0.1 V 时去甲肾上腺素和多巴胺这种区分最为明显。 Ross 等[47]开发了一种类似梯形的波形,能够选择性地检测腺苷、过氧化氢和ATP。 该波形与传统波形相比有着更低的检测限,并且能够提高在高扫描速率下电极的稳定性。 Park 等[48]将循环方波伏安法和背景减除相结合开发出快速循环方波伏安法(FCSWV),该方法极大地提高了对DA 检测的灵敏度。 当DA 浓度为0.5 ~ 2 μmol/L 时,FCSWV 的检测极限为5 ~ 9 nmol/L,而相同情况下FSCV 检测极限为11 ~ 37 nmol/L。 除灵敏度增加外,与常规FSCV 比,FCSWV能更好地区分大鼠纹状体中多巴胺与其他的神经递质。 随着交替波形开发(传统三角形波形之外)以及专用探针的不断进步,FSCV 可实现同时、多重检测不同的神经化学物质[49]。 随着对FSCV 不断地了解和开发,相信定能解决现代神经递质研究中所面临的一系列问题。

3 荧光传感器法

荧光检测是一种高特异性、高时空分辨率和良好的生物相容性的蛋白质动力学实时检测技术。该技术需引入荧光素基团对神经递质进行标记,通过检测和分析荧光信号的强度,完成对神经递质浓度的监测。 根据此原理,本文详细综述两类较为成熟的实时可视化监测神经递质的荧光传感器[50]。

3.1 基于FRET 的蛋白质传感器

荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer,FRET)是激发态的供体荧光团通过偶极间的相互作用将其激发能以非辐射方式传递给受体荧光团,从而导致受体荧光团发光的技术,如图4A[51]。 自1948 年发现以来,FRET 已经发展成为检测分子之间,尤其是蛋白质之间相互作用的强大工具,为生物医学研究的广泛领域开辟了新的可能性[52]。 Okumoto 等[53]利用能够与神经递质结合的细菌周质结合蛋白(PBPs)作为传感器支架,将来自大肠杆菌的谷氨酸/天冬氨酸结合蛋白ybeJ(也称GltI)与绿色荧光蛋白的两个变体融合,研发出初代Glu 荧光指示蛋白(FLIPE),对谷氨酸的亲和力约为600 nmol/L,时间分辨率约为1 ms,如图4B。 Masharina 等[54]基于FRET 技术,将SNAP-tag、CLIP-tag 和目标分析物的受体蛋白(RP)组成融合蛋白,研发出半合成荧光传感器蛋白(Snifit)。 该传感器以高特异性和高时间分辨率在哺乳动物活细胞表面检测γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酸的检测浓度在微摩尔至毫摩尔的范围内,时间分辨率在1 ~ 10 s的范围内,在研究生物系统中γ-氨基丁酸的作用发挥着重要的价值。

图4 FRET 基本原理与基于FRET 原理的谷氨酸传感器Note. A. The basic principle of FRET. Donor fluorophore in the excited state transfers its excitation energy to the acceptor fluorophore in a nonradiative manner through the interaction between dipoles, thereby causing the acceptor fluorophore to emit light. B. Based on the principle of FRET Schematic diagram of the glutamate sensor. First glutamate sensor was designed by fusing GltI from Escherichia coli with a FRET pair consisting of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP). GlTI is the molecular recognition domain of the sensor. When it binds to glutamate, its conformation changes, causing YFP and CFP to move away from each other, and the FRET efficiency decreases.Figure 4 Basic principle of FRET and glutamate sensor based on FRET principle

由于多巴胺和去甲肾上腺素结构上的相似性,在电化学传感器等检测方法中这两种神经递质的检测信号也较为相近。 而之后开发的一系列基于细胞的神经递质荧光工程报告程序(CNiFERs),不仅能分别通过D2 受体、α1A 受体和M1 受体,完成对多巴胺、去甲肾上腺素以及乙酰胆碱的选择性检测,而且能精确定位所检测的位置和时间,时间分辨率在1 ~ 10 s 的范围内[55-56]。 与FLIPE 和Snifit系统相比,CNiFER 系统已经在体内得到了广泛的表征。 Muller 等[57]将CNiFERs 注射到小鼠的前额叶皮质,使用双光子显微镜测量条件反射过程中神经递质的释放。 在该方法中,D2 CNiFER 对多巴胺表现出纳摩尔级别的灵敏度,而去甲肾上腺素的灵敏度比多巴胺低了30 倍左右,多巴胺的检测浓度为2.4 ~ 2.6 nmol/L,而去甲肾上腺素的检测浓度为73 ~ 89 nmol/L。 同样,α1A CNiFER 对去甲肾上腺素表现出纳摩尔级别的灵敏度,去甲肾上腺素的检测浓度为18 ~ 20 nmol/L,而多巴胺的检测浓度为1.3 ~ 1.5 μmol/L。 虽然CNiFER 不能分辨单个突触的神经传递,但仍然是体内监测神经递质最有特色的方法之一。

Marvin 等[58]将循环重排绿色荧光蛋白(circular permutated enhanced green fluorescenr protein,cpEGFP)插入到GltI 中开发出了iGluSnFR,增强了与Glu 结合时的荧光信号,并在神经元、视网膜、蠕虫、斑马鱼以及小鼠中都能长期稳定的成像。 与CNiFERs 相比,iGluSnFR 可以快速直接进入突触间隙,有着更适合于体内成像的信噪比和动力学,其对谷氨酸的亲和力在98 ~ 116 μmol/L 的范围内,时间分辨率在约为5 ms 的范围内,检测范围为1 ~ 10 mmol/L。 Marvin 等[59]用环重排超折叠绿色荧光蛋白(circularly permuted superfolder green fluorescent protein, cpSFGFP ) 取代了原来的cpEGFP,开发出了SF-iGluSnFR。 虽然SF-iGluSnFR的动力学与最初的iGluSnFR 相比要慢,但SFiGluSnFR 具有更高的亲和力和灵敏度,比iGluSnFR更适用于监测突触中谷氨酸的快速释放[60]。Helassa 等[61]在最初的iGluSnFR 的基础上,设计出了iGluf和iGluu两种新的变体,其中iGluu能够在100 Hz 的频率下直接报告大鼠海马神经元细胞中单个谷氨酸的释放,检测范围为0.01 ~ 10 mmol/L。虽然与iGluSnFR 相比,iGluf和iGluu的亲和力有所降低,但这两种变体在体外的构象变化速度和在突触中的动力学速度分别提高了6 倍和5 倍[62]。

3.2 基于G 蛋白偶联受体的蛋白质传感器

G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是最大的膜受体家族,近年来,已开发了一系列基于GPCR 的传感器来测量神经递质,比如ACh 传感器(GACh)、DA 传感器(GRABDA)和NE传感器(GRABNE),如图5 所示,以及通过人类DAD1 和D4 受体进行检测的dLight 系列探针[63]。与PBPs 作为传感器支架相比,基于GPCR 传感器在原理上可达到相似的灵敏度和响应动力学,但在检测相应的神经递质时具有更好的亲和力和选择性。

图5 基于G 蛋白偶联受体的荧光传感器Note. GPCRs consist of seven α-helical transmembrane domains (TMs), and the conformation of the cytoplasmic end of TM6 changes the most when a ligand binds to the GPCR. Ligation of TM5 and TM6 is accomplished by cpGFP inserted into the third intracellular loop domain of GPCRs to detect conformational changes that occur upon GPCR binding to ligands. Ligand binding induces a conformational change in the GPCR resulting in increased fluorescence.Figure 5 Fluorescent sensor based on G protein-coupled receptors

Patriarchi 等[64]开发了一种基于遗传编码的多巴胺传感器——dLight1,该传感器能够以高时空分辨率监测小鼠纹状体中多巴胺毫秒级的变化情况,该传感器对多巴胺亲和力在300 ~ 360 nmol/L 的范围内。 研究表明dLight1 在研究药理操作、电生理或光遗传学刺激等情况下多巴胺的动态变化时具有很强的实用性。 Patriarchi 等[65]还设计除了干扰性小和光稳定性强的RdLight1,RdLight1 对多巴胺的亲和力为229 nmol/L,检测范围为0.01 ~ 100 μmol/L,为扩展基于GPCR 的传感器的颜色光谱提供了一个范例。 Sun 等[66]用cpGFP 取代了多巴胺D2 受体GPCR 的第三细胞内环,经过广泛的优化制备出了对多巴胺具有高度特异性的GRABDA,该传感器具有亚细胞分辨率、亚秒动力学、较大的表观亲和力以及出色的分子特异性,能够实时检测活蝇、斑马鱼和小鼠等多个模型系统中内源性多巴胺的动态变化。 GRABDA对多巴胺的亲和力为130 nmol/L,时间分辨率不大于100 ms。 dLight 和GRABDA在HEK293 T 细胞中都具有很好的表达和良好的性能。

Jing 等[67]开发了一系列基于GPCR 的GACh,能够选择性地响应外源性和内源性乙酰胆碱,并通过双光子显微镜捕捉到强烈的荧光信号,具有良好的灵敏度、配体特异性、动力学和光稳定性。 该传感器在对乙酰胆碱的亲和力为100 μmol/L,时间分辨率在毫秒级别的范围内。 Feng 等[68]利用配体结合时第五和第六跨膜域之间的构象变化来调节结合的荧光蛋白的亮度,开发了一系列基于GPCR 激活的GRABNE。 研究发现,GRABNE具有很高的灵敏度、特异性和光稳定性,对去甲肾上腺的亲和力在纳摩尔至微摩尔的范围内,时间分辨率在亚秒级别的范围内, 检测范围为0.1 ~ 100.0 μmol/L。GRABNE能快速、特异地监测小鼠生理和病理过程中体内去甲肾上腺素的动态变化,对于了解去甲肾上腺素在复杂行为中的调节和影响具有重要的作用。表2 为不同种类的荧光传感器在神经递质检测方面的比较。

表2 不同种类的荧光传感器在神经递质检测方面的比较Table 2 Comparison of different kinds of fluorescence sensors for neurotransmitter detection

4 总结与展望

神经递质是神经系统中重要的化学信使,在维持人体正常的生命活动中扮演着十分重要的角色。虽然已有关于神经递质检测技术的文章,但大部分文章只着重讨论某一类神经递质检测技术。 本文对目前常用的能够实时监测体内神经递质的技术进行了全面的回顾。 详细阐述了各个检测方法的原理及其应用,比较了这些方法的优缺点,如表3 所示。 当面临不同的情况时,可以为选择合适的技术提供了良好的参考。

表3 神经递质检测工具之间的比较Table 3 Comparison between neurotransmitter detection tools

在自由活动的动物模型甚至人类中,对神经化学动力学的微侵入性监测仍然是具有挑战性的。除了上面讨论的技术外,研究者们还开发了其他基于化学和细胞的方法来监测神经化学动力学[69]。随着材料学、生物和化学等领域中各种新技术的不断发展,大脑神经递质检测技术的研发将会被推向一个新的水平。 神经科学的研究者们提出的新问题和在创造各种技术中吸取的经验教训将成为开发新的检测神经递质方法的纽带[11]。 神经递质的检测研究已经具备较好的基础,许多技术正在经历广泛的创新并显示出巨大的未来前景,未来神经递质检测技术将继续向着无创、实时可视化以及信号放大等方向发展。