大鼠BMG吸附MSCs修复骨缺损的可行性及有效性研究

卢志华 孙煜喆 许丁文

在临床骨科研究中，关于骨缺损修复的研究较为困难，临床对使用人工合成骨、自体骨移植、异体骨移植等方式进行骨缺损修复[1-3]。其中自体骨移植为修复骨缺损的最好方式，但自体骨来源获取较为困难，可限制临床自体骨移植的使用。临床研究中，关于修复骨缺损的研究逐渐增多，多采用组织工程的方法构建新生骨组织，且种子细胞的选取和培养为骨组织工程学中的重要步骤，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）既可修复关节软骨面的缺损，也可修复包括软骨下骨的关节软骨缺损，是最佳理想的种子细胞的选择[3-5]。临床骨组织工程学的研究，载体选择具有重要作用。同种异体骨基质明胶（bone matrix gelatin，BMG）是异体骨经过脱钙等一系列过程处理后的产物，含有在加工处理过程中未被破坏的骨形态发生蛋白骨成形蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），而BMPs 是具有成骨诱导活性的一组生长因子，有利于骨的生长和再生[6-7]。基于此，本研究以MSCs 为种子细胞，以大鼠BMG 为载体，探讨大鼠BMG 吸附MSCs 修复骨缺损的可行性及有效性，以期为临床构建骨缺损的修复提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

54 只成年雄性美国斯泼累格·多雷（sprague-dawley，SD）大鼠[浙江省中药研究所有限公司，SYXK（浙）2023-0025]，无特定病原体级（specific pathogen free，SPF），购自实验动物中心，SD 大鼠体质量为231～284 g，平均（257.25±12.87）g，饲养于温度为22～23℃、湿度为60%的无菌环境中，光照为12 h 光照/黑暗周期，所有大鼠经过5 d 适应期后进行实验。本研究获得扬州市职业大学医学院动物保护委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 BMG 的制备

取SD 大鼠，解剖分离四肢长骨，去除软组织，用蒸馏水反复冲洗清除骨髓组织，依次进行脱钙、脱脂、冻干和灭菌处理，并保存于4℃冰箱中备用。

1.2.2 MSCs 的分离与培养

取SD 大鼠，100 g/L 水合氯醛麻醉，采用75%乙醇浸泡20 min，无菌条件下取出两侧肱骨和股骨，刮除软组织、骨膜和干骺端的软骨部分，剪去骨骺端，骨髓用含10%胎牛血清的l-dmem 完全培养基洗涤，混合均匀后接种于细胞专用培养瓶，并加入10%的灭活FBS，放入含有5% CO2的37℃培养箱中继续培养，当细胞的融合度至80%～90%时，采用0.25%的胰蛋白酶对细胞进行消化处理，后实施传代培育，按1∶3 的比例传代扩增。

1.2.3 骨缺损模型的制备

100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉后（3 mL/kg），无菌暴露双侧桡骨中段按照长骨缺损临界值制成5 mm 节段性缺损。

1.2.4 实验分组

共有18 只大鼠骨缺损模型制备失败，将制备成功36只大鼠分为每组18 只，对照组BMG 植入，实验组MSCs经荧光标记后与BMG 共同培养植入。均不予以内外固定，逐层缝合伤口。

1.3 观察指标

（1）分别于术后1、2、3 周、1、2 个月处死大鼠2 只，比较各组成骨效应。（2）观察术后2个月取骨缺损区组织形态，采用荧光染料标记实验组骨缺损区的骨痂，判断骨痂来源。

1.3.1 骨缺损区放射学评分检测

术后1、2、3 周、1、2 个月麻醉下行左侧前肢正侧位X 射线检查。后根据X 射线片评分标准对X 射线进行评分[8]。0 分：无骨形成，可见骨连接线，缺损区未形成骨髓腔；2 分：新生骨占缺损区域的50%，可见部分骨折线，缺损区骨髓腔形成再通；4 分：新生骨占缺损区域的100%，未见骨折线，缺损区骨髓腔形成再通后腔内皮质骨形成。

1.3.2 骨缺损修复组织学评分检测

术后1、2、3 周、1、2 个月截取大鼠修复部位标本，固定于40 g/L 多聚甲醛中，并进行脱水、包埋处理，制作5 张切片，切片厚度为0.5 μm，后进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE staining），光学显微镜下对组织的结构与细胞的形态进行观察，并按照组织学评分标准对各组标本进行评分[9]。1 分：缺损区域受到新形成的结缔组织（含有毛细血管、成纤维细胞、巨噬细胞、新形成的胶原纤维）填充，且结缔组织较疏松；2 分：密集结缔组织处，具有较多的大量分化细胞，且纤维有序排列；3 分：形成较多新骨，结缔组织分化形成骨基质、骨单位；4 分：产生骨组织。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析处理。计量资料以（）表示，采用t检验；正态分布检验和方差齐性检验采用Kolmogorov-Smirnov 检验与Levene 检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组成骨效应比较

对照组类骨样组织形成量较实验组同期标本明显较少，且骨量与成熟程度均明显低于实验组。见表1、图1。

图1 术后2 个月检测情况（×100）。对照组BMG 部位可见骨组织形成，但骨量与成熟程度较低，具有炎性细胞浸润；实验组毛细血管及结缔组织增多，形成大量新骨。

表1 实验组与对照组成骨效应比较

2.2 两组荧光染料标记情况比较

通过荧光染料标记确认，胫骨骨缺损区的骨痂来源于MSCs。见图2。

图2 术后2 个月二脒基苯基吲哚（diamidinyl phenyl indole，DAPI）染色组织切片荧光染料标记情况（×150）。对照组胫骨骨缺损区的骨痂形成较少，缺损区边缘带有少量骨痂组织；实验组胫骨骨缺损区形成大量骨痂。

2.3 两组大鼠骨缺损区放射学评分比较

与对照组比较，实验组1、2、3 周、1、2 个月放射学评分较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 实验组与对照组大鼠骨缺损区放射学评分比较（分，）

表2 实验组与对照组大鼠骨缺损区放射学评分比较（分，）

2.4 两组大鼠骨缺损修复组织学评分比较

与对照组比较，实验组1、2、3 周、1、2 个月组织学评分较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 实验组与对照组大鼠骨缺损修复组织学评分比较（分，）

表3 实验组与对照组大鼠骨缺损修复组织学评分比较（分，）

3 讨论

本研究结果显示，对照组类骨样组织形成量较实验组同期标本明显较少，且骨量与成熟程度均明显低于实验组。HE 染色确认胫骨骨缺损区的骨痂来源于MSCs。成骨效应分析：在SD 大鼠的胫骨骨缺损区，植入MSCs 与BMG 的复合物，根据骨缺损区局部微环境的诱导因子对成骨进行调控，但成骨细胞的调控可受到局部血供的影响，使细胞的分化，骨缺损区具有良好的血供可分化为成骨细胞，血供不足可分化为软骨细胞[10]。本研究结果显示，MSCs 与BMG 复合组的骨缺损修复能力高于单纯BMG 组，且单纯BMG 组成骨能力较好。大鼠进行移植骨缺损后，未发现异型、炎性细胞，表明该方式不会造成瘤变、排斥反应，安全性较强。

而单纯BMG 具有具有一定成骨能力，分析原因在于：BMG 中含有较多BMPs，且未受到破坏，BMPs 为生长因子，具有较强的诱导活性，可诱导血管周围未分化的MSCs 成骨分化[11-12]。BMPs 可使MSCs 的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性增加，并增强间充质细胞活性，使细胞外基质钙盐沉着[13-15]。MSCs成骨细胞分化时，可抑制脂肪细胞的分化，使骨形成、再生速度加快[16-17]。

本研究发现，对照组大鼠在3 周、1 个月时在少量溶解吸收BMG 区域形成类骨样组织，但实验组大鼠在2 周后BMG 区域出现类骨样组织，该结果表明，实验组的成骨效果优于对照组。在2 个月时，对照组BMG部分出现骨组织形，但与实验组比较，具有较少骨量，且成熟度较晚，为早期骨组织的形成表现。原因可能为，BMPs 通过局部间充质细胞诱导成骨细胞分化，但成骨细胞的分化数量低于骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，rMSCs），故导致对照组低于实验组同一时间成骨量，延长临床骨质生成时间。

本研究选用BMG 作为rMSCs 载体，原因为BMG 可运输机体内种子细胞，使其发生黏附且BMG 可促使毛细血管的生长，使载体基质溶入受体骨基质，BMG 可使受体细胞、种子细胞共同作用，形成骨痂，在临床研究中具有重要作用。

综上所述，大鼠BMG 吸附MSCs 修复骨缺损具有可行性及有效性。