没食子酸乙酯的生物活性研究进展

武涛,张绚,刘慧,刘菲,郝婷婷,韩婷婷,杨素珍

(福瑞达生物股份有限公司,山东 济南 250101)

重点综述了近年来关于没食子酸乙酯生物活性的相关研究。没食子酸乙酯(Ethyl gallate,EG),属没食子酸烷基酯的一种,化学名为3,4,5-三羟基苯甲酸乙酯,白色结晶粉末,溶点149～153 ℃,可溶于水。EG主要存在于钩锥叶、余甘子果实、小果蔷薇根、五倍子根部和芍药等中草药植物,具有广泛的生物活性,能够有效清除自由基,抑制炎性细胞激活,调节脂质代谢和保护神经系统等,涉及众多与疾病防治相关的研究领域,图1为EG的药理作用。

图1 EG的药理作用

1 抗氧化作用

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)作为调节生物体生命活动的信号分子,在生命活动中发挥重要作用。ROS种类繁多,主要包括过氧化氢(H2O2)、次氯酸、羟基自由基(·OH)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)和超氧阴离子自由基(·O2-)。ROS水平的变化与许多疾病的发生发展密切相关[1]。EG的抗氧化作用使其成为抗氧化失衡相关疾病的有效化合物。

内源性低水平的H2O2可作为信号转导的重要调节因子,激活多种信号通路[2]。然而,过量的细胞H2O2会触发毒性反应过程[3]。在血管组织中,当H2O2扩散到邻近的血管平滑肌时,可引起局部肥大现象,严重者可诱发血管炎症,最终导致慢性血管疾病。

EG的抗氧化性能使其成为一种良好的H2O2清除剂。有研究表明,在脓毒症犬中注射EG后,血清中H2O2浓度明显降低,低血压症状缓解。EG阻止了过氧化氢酶被过氧化氢类似物过氧乙酸转化,从而保护过氧化氢酶活性。这证明,EG通过清除过量的H2O2,抑制过氧化氢酶(Catalase,CAT)变性,从而发挥抗氧化作用,调节血压稳定,抑制血管功能障碍[4]。

除H2O2外,羟自由基还会损伤体内蛋白质、DNA等生物大分子,导致癌症、动脉粥样硬化和神经变性的患病率增加。EG加入Fenton反应体系(Fe3+/H2O2/抗坏血酸)后,可与DNA形成插入式复合物,保护DNA大分子免受氧化应激损伤,并通过提供氢离子中和羟自由基,发挥自由基清除机制,保护DNA和蛋白质免受氧化损伤[5]。体内的过氧化产物,如脂质过氧化物,会降低抗凝因子的活性,导致血液处于高凝状态形成血栓,而EG可降低羟自由基对抗凝血酶Ⅲ活性的氧化损伤,发挥抗氧化作用抑制血栓形成[6]。

EG在体外能够清除超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢,表现出抗氧化作用[7]。Sawai等学者[8]通过核磁共振方法,分析了EG清除DPPH自由基的分子机制,即作为供电子化合物,在清除DPPH自由基的同时自身被氧化为没食子酸乙酯自由基(氧化形式),该产物具有非常稳定的结构,难从自由基清除后产生的氧化形式还原,从而可以表现与α-生育酚(抗氧化剂)相当的抗氧化能力。

氧化应激在神经退行性疾病和肿瘤中起着至关重要的作用。EG的抗氧化特性使其成为一种良好的抗氧化应激药物,可通过调节氧化应激反应的平衡来缓解相关疾病的发展。

Ren等学者[9]利用H2O2刺激PC-12细胞建立典型的氧化应激神经损伤细胞模型,发现不同剂量EG(10、20、40 μmol/L)干预PC12细胞后可增强H2O2诱导的细胞活力,阻断核碎裂和DNA凝集,显著改善细胞状态。通过流式细胞术、qRT-PCR、免疫荧光和western blot等检测方法证明其减少PC12过度释放ROS、抑制半胱天冬酶(caspase )9/3活化、破坏DNA修复酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)和维持线粒体膜电位,调控凋亡相关Bax/Bcl-2比值和细胞色素C(Cytochrome C)释放,减缓了氧化应激。此外,EG还会激活细胞防御机制的主要调节因子核红细胞2相关因子2(Nrf2)的核移位,增强其下游靶点γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]的表达和上调谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,从而在内源性途径中发挥抗氧化作用。

Chandrasekaran等学者[10]发现,EG(10 mg/kg)灌胃治疗4-硝基喹啉-1-氧化物(4- NQO)诱导的口腔癌小鼠后,与4-NQO组相比,改善小鼠体重,降低肿瘤负荷50%,减少异常增殖细胞50%,未发生鳞状上皮细胞癌,并降低脂质过氧化水平。通过增强超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)等抗氧化酶的活性,提高还原型谷胱甘肽(GSH)、维生素C(Vitamin C,VC)和维生素E(Vitamin E,VE)等非酶抗氧化剂的释放水平,可逆转异常增生的肿瘤细胞为正常上皮结构,从而发挥抗癌作用。

过量的糖摄入会增加葡萄糖代谢的有毒代谢物产生,从而加重内源性抗氧化和解毒系统的负担。HoYin Lip等学者[11]发现EG干预大鼠肝细胞后,通过减少ROS生成和保护线粒体膜电位发挥抗氧化作用,保护肝细胞免受乙二醛、甲基乙二醛等毒性代谢物引起的氧化损伤。

2 抗炎作用

炎症反应是机体重要的防御过程,有助于维持机体的完整性,抵御物理、化学和病毒的感染性损伤,而过度的炎症会损害正常的器官和身体状态。因此,抑制炎症反应的过度发生对保护机体至关重要。

2.1 抑制动脉粥样硬化中的炎症反应

单核细胞和T淋巴细胞与血管内皮的黏附是动脉粥样硬化炎症反应中最早且必不可少的过程之一。这一过程由内皮-白细胞黏附分子(endothelial-leukocyte adhesion molecules,ELAMs)介导,ELAMs表达于血管内皮表面,覆盖动脉粥样硬化和炎症病变。

Murase等学者[12]检测了HL-60(一种早幼粒细胞单核细胞系)在静态条件下与细胞因子激活的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的黏附,发现EG(3 ～ 10 mmol/L)预处理HUVECs后,可抑制NF-kB p65的核转位,降低白细胞介素-1α (IL-1α)或肿瘤坏死因子-a (TNF-a)诱导的NF-kB活性进而减少血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞黏附分子-1(ICAM-1)和e-选择素的表达、降低白细胞黏附发挥抗炎特性。

Liu等学者[13]研究发现,不同剂量的EG腹腔注射于ApoE-/-小鼠后,降低了血清中炎性因子IL-6、TNF-α和趋化因子MCP-1等相关因子的浓度,免疫荧光检测发现EG可降低小鼠动脉弓部位的炎性细胞浸润情况。在斑马鱼模型中,研究发现EG可抑制中性粒细胞的生成与迁移。EG可通过抑制炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用。在体外模型细胞实验中,EG还能抑制RAW264.7中炎症因子IL-6和TNF-α发挥抗炎作用,与体内试验结果一致。

2.2 抑制肺损伤中的炎症反应

炎症及其伴随的过度氧化应激反应与肺损伤(acute lung injury,ALI)的进展和结果密切相关。Mehla等学者[14]发现,不同剂量(1,5和10 mg/kg) EG腹腔注射小鼠可减轻肺泡水肿、出血,以及中性粒细胞在血管和肺泡区及其周围的积累,对小鼠的肺损伤具有保护作用。

EG可上调脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)损伤小鼠模型中血红素氧合酶(Hemeoxygenase -1,HO-1)的表达,降低Keap-1水平,增强Nrf2的核内聚集,并上调SOD3的表达来发挥抗炎作用。此外,单核细胞释放的细胞因子和趋化因子启动中性粒细胞内流现象,在LPS诱导的急性肺损伤的免疫应答中发挥关键作用。以人单核细胞系THP-1作为体外模型,模拟LPS诱导的急性肺损伤的炎症状态,发现EG在体外抑制炎症因子TNF-α,并通过激活Nrf2上调THP-1中HO-1的表达,发挥抗炎作用保护肺损伤[14]。

Zhang等学者[15]也发现以EG为主要活性成分的中药汤剂对LPS诱导的急性肺损伤大鼠模型具有保护作用。EG预处理显著抑制肺水肿,减轻肺组织学病变,减少支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的中性粒细胞、ROS、促炎细胞因子和白蛋白水平,在体内(BALB/c)和体外模型(人单核细胞)中均减轻ALI中的炎症状态。富含EG提取物显著减少LPS诱导的肺组织炎性细胞浸润。EG预处理可降低BALF中 W/D比值和蛋白含量,减少BALF中活化的中性粒细胞浸润,显著抑制肺水肿,减轻肺组织学改变。

2.3 抑制皮肤病中的炎症反应

天然成分也经常用于治疗炎症和疼痛相关疾病,如伤口、关节炎症、炎症性皮肤病和其他炎症性疾病[16]。

除上述抗炎作用外,EG也具有其他部位炎症的抑制作用,比如过敏性疾病和伤口发炎等。过敏性皮炎的发展机制与肥大细胞脱颗粒现象、组胺释放水平等密切相关[17]。Minami等学者[18]发现,EG干预肥大细胞后,可以显著抑制C48/80诱导的组胺释放,抑制率为36.7%±1.33%。这表明EG可以抑制组胺释放,进而发挥抗炎作用缓解过敏性疾病。

IL-6在急性炎症中被诱导生成,并通过促进单核细胞募集触发急性炎症向慢性炎症的转变。虽然正常水平的促炎细胞因子可以防止感染并加速伤口的正常愈合,但过度生成细胞因子是有害的,因为它会导致炎症和伤口愈合延长[19]。因此,对抗促炎细胞因子的过度产生可以介导慢性伤口愈合的治疗效果。Toafode等学者[20]在体外实验中发现,用TNF-α刺激的人角质形成细胞(HaCaT)作为皮肤炎症模型来鉴定EG的治疗效果,发现EG可以通过抑制促炎细胞因子IL-6的释放来发挥抗炎作用。

2.4 其他抗炎的相关研究

炎症反应贯穿在各种疾病发生发展中,除了炎性因子IL-1α、IL-6和TNF-α外,NO等炎性介质及其相关酶也对炎症的发展发挥着重要作用。

Wang等学者[21]研究发现,从分心木提取分离的EG干预小鼠巨噬细胞系RAW 264.7后,可抑制巨噬细胞释放一氧化氮(nitric oxide,NO)水平,发挥抗炎作用。Park等学者[22]进一步研究发现,EG干预RAW 264.7巨噬细胞后,抑制LPS刺激巨噬细胞后NO的释放水平,显著减弱LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达,显著抑制LPS诱导的iNOS mRNA的积累,提高细胞核内Nrf2的水平,证明EG可阻断LPS诱导的巨噬细胞内iNOS活性表达和激活Nrf2/HO-1信号通路从而发挥抗炎作用。

3 治疗代谢性疾病

代谢性疾病在我国的患病率逐年上升,这主要是人们生活水平和饮食结构发生变化引起。此类疾病主要包括糖代谢和脂质代谢两个领域。糖脂代谢性疾病主要包括糖尿病、动脉粥样硬化、高脂血症和戈谢病等。目前众多研究学者对此类疾病的攻克集中于天然产物方向,并且取得了一定的研究进展。

3.1 糖代谢疾病

糖脂代谢性疾病主要以糖脂代谢紊乱为特征,由遗传因素、环境因素和生活方式等多种因素参与。Ⅱ型糖尿病(T2D)已成为一种常见的糖代谢疾病。若控制不当,会增加大血管、微血管及代谢性并发症的风险,适当的血糖控制对糖尿病患者非常重要。目前预防Ⅱ型糖尿病的方法包括抑制α-葡萄糖苷酶、刺激胰岛素分泌、增加胰岛素敏感性和抑制肠道葡萄糖转运等。

Ahn等学者[23]发现EG干预后3T3-L1细胞内脂滴积聚减少,通过降低过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)和增强子结合蛋白α转录调节因子(CCAAT/enhancer binding proteins α,C/EBPα)的表达来抑制3T3-L1细胞内早期脂肪形成。解析出EG激活腺苷酸活化蛋白激酶(5-AMP activated protein kinase,AMPK)抑制3T3-L1细胞脂肪生成,刺激葡萄糖摄取,从而发挥抗糖尿病和抗肥胖作用。此外,通过分子对接研究EG与蛋白酪氨酸磷酸酶非受体6型(Protein tyrosine phosphatase non receptor type-6,PTPN6)和PPARγ的结合能力,以此佐证了EG的抗糖代谢作用机制。

降低餐后血糖和随后胰岛素峰值水平是抑制肠道对葡萄糖转运的治疗途径之一。Wang等学者[24]在Caco-2细胞中用一定剂量的EG进行干预后,可控制餐后肠道葡萄糖转运水平,使餐后血糖水平降至稳定状态。

α-葡萄糖苷酶又称α-d-葡萄糖苷水解酶,是参与机体葡萄糖代谢过程、影响体内血糖浓度的一种重要水解酶。薛琛等学者[25]通过紫外分光光度法、同步荧光光谱法和分子对接技术发现,EG ( IC50=2.97 mg·mL-1)通过氢键与疏水作用力与α-葡萄糖苷酶自发结合形成稳定的复合物,对α-葡萄糖苷酶活性表现出良好的抑制作用。另外,分子对接显示EG与α-葡萄糖苷酶的疏水口袋结合并形成氢键,对接能量为-26.48 kJ·mol-1,这佐证了EG对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,其具有抗糖代谢的潜力。

3.2 脂质代谢疾病

脂质代谢疾病中典型的是动脉粥样硬化,这是一种由炎症和脂质代谢紊乱引起的慢性疾病。因此,研究和治疗脂质沉积和炎症是抑制动脉粥样硬化早期病变发展的有效途径。

Liu等学者[13]发现给ApoE-/-小鼠(一种以脂肪条纹为典型特征的早期动脉粥样硬化病变模型)腹腔注射EG (20 mg/kg)可显著减少主动脉和主动脉弓内脂质沉积斑块面积和炎性细胞浸润。血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)浓度升高2倍,且MCP-1、IL-6和TNF-α水平显著降低。

斑马鱼作为一种新兴的疾病动物模型也常用于研究脂质代谢紊乱性疾病的研究[26]。一项研究证明,一定剂量EG喂食斑马鱼后,显著改善了体内的血管胆固醇沉积以及中性粒细胞的生成和迁移[13]。

在细胞实验中,EG (20 μmol/L)处理巨噬细胞和内皮细胞减少泡沫细胞的数量,并抑制细胞内促炎细胞因子IL-12p70、IL-6、MCP-1和TNF-α的释放。EG可通过激活脂质转运蛋白ABCA1(ATP-binding cassette transporter A1)和ABCG1((ATP-binding cassette transporter G1)),促进胆固醇外流,减少氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)蓄积,抑制巨噬细胞泡沫细胞转化,从而调节脂质紊乱[13]。

低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的氧化修饰与动脉粥样硬化的发生密切相关。LDL在血管壁的沉积和修饰会导致单核细胞募集到血管内皮下间隙,进而分化为巨噬细胞。巨噬细胞大量地吞噬经过氧化修饰的LDL颗粒,向泡沫细胞状态转变,随后泡沫细胞破裂,触发动脉粥样硬化性疾病的恶化。EG抑制细胞因子诱导的NF-kB核转运和血管内皮细胞中白细胞黏附分子的表达,抑制巨噬细胞过量吞噬ox-LDL,缓解细胞内脂质代谢紊乱,具有调控脂质平衡的潜力[27]。

4 其他作用

除上述作用外,EG还有多种生物活性。EG可以调节血压。Lim等学者[28]发现EG及其提取物通过抑制Ca2+和Na+内流进入肾上腺髓质嗜铬细胞,激活iNOS增加NO生成来介导Ca2+摄取减少进入细胞质Ca2+储存,从而抑制乙酰胆碱诱发的儿茶酚胺类激素分泌,发挥有益的抗高血压活性。

EG具有抗过敏和镇痛作用。组胺是触发过敏反应的重要介质,抑制其在细胞内的分泌可起到抑制过敏的作用。 Minami等学者[18]发现,EG抑制化合物C48/80诱导的大鼠腹腔肥大细胞组胺释放。此外,EG以剂量依赖性通过调控K+通道的激活和Gi/o蛋白的痛觉敏感机制,在小鼠和大鼠的不同化学、机械和热伤害性感受模型中发挥抗痛觉过敏、抗伤害性感受作用[29]。

5 小结与展望

EG是一种存在于多种药用植物和天然食物中的代谢产物,如余甘子、葡萄酒和白芍等。近年来,EG在医药领域的研究和应用呈上升趋势。虽然EG的抗炎、抗癌和抗菌作用已被研究,但具体作用机制尚未明确。在调节糖脂代谢方面,多数研究为理论和体外细胞实验,缺少动物模型等,仍需进一步研究。这一不足之处也是后期重点研究的潜在方向。另外,EG作为一种多酚类化合物,虽然具有广泛的生物活性,但具有易氧化的缺点限制了其应用。如果对其进行大分子包封和修饰或将扩大研究范围,加速其开发与应用。EG的研究和利用越深入,对EG的认识就越全面,这将为今后的科学制药和临床用药提供重要依据。