基于LC-MS 技术的逍遥散治疗抑郁症的代谢组学实验研究

高超，张军会，宋晓飞

1.南阳市第四人民医院中西医结合科，河南南阳 473000；2.南阳医学高等专科学校临床系，河南南阳 473000；3.南阳市中心医院中医科，河南南阳 473000

抑郁症是一种常见的精神疾病，抑郁症患者常见的神经递质异常包括血清素、多巴胺和去甲肾上腺素的不平衡[1]。长期的抑郁状态可能导致神经结构和功能的损伤[2]，包括海马体和前额叶皮质的萎缩，慢性炎症反应在抑郁症的发病中起到了重要作用。然而，目前针对抑郁症的治疗方法仍然有所欠缺，存在一些不良反应，主要包括抗抑郁药物的使用可能引起一系列的不良反应，如嗜睡、失眠、食欲改变、性功能障碍等，且疗效不尽如人意。因此，寻找具有较高疗效和较少不良反应的治疗抑郁症的方法和药物非常重要。逍遥散是一种传统中药方剂，已广泛用于治疗抑郁症。逍遥散由多种药材组成，包括人参、黄芩、白芍等[3]。尽管逍遥散在治疗抑郁症方面显示出一定的疗效，但其作用机制尚未完全阐明。代谢组学是一种研究生物体代谢物在生理和病理条件下整体变化的分析方法[4]。通过对代谢物组成的研究，可以为疾病的发病机制和治疗提供新的视角和理论依据。液相色谱质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS）技术是近年来得到广泛应用的代谢组学分析方法，具有高分辨率、高灵敏度、高通量等优势。本研究选取2021年6月—2022年6月在南阳市第四人民医院接受治疗的36 例抑郁症患者作为研究对象，旨在利用LC-MS 技术研究逍遥散治疗抑郁症的作用机制，并进一步研究了逍遥散对氧化应激通路的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 试剂及仪器

甲醇和甲酸、HPLC 级乙腈、MS3 漩涡混合器、数控超声仪KQ2200 型、TGL-16 型高速台式离心机、Adventurer AR1140 型天平、Captiva 96 过滤装置

1.2 样本采集及制备

选择本院收治的抑郁症患者36 例为研究对象，空腹抽取抑郁症患者服用逍遥散8 周后的静脉血。确保使用无菌采集器具，以防止外源性污染。将采集的血液样本放置于离心管中，并轻轻倒置几次以确保抗凝剂均匀混合。将离心管置于离心机中，以适当的速度和时间进行离心。通常离心速度为2 000～3 000 r/min，离心时间为10～15 min。这将血液分离为3 个部分：上层为血浆、中层为白细胞层、底层为红细胞层。使用微量吸管或移液管，将血浆小心地转移到新的离心管中。避免移入任何可见的悬浮物或红细胞，以保持纯净度。对血浆样本进行蛋白沉淀以去除潜在的蛋白质干扰物，常使用甲醇或丙酮等有机溶剂进行沉淀。将适量的有机溶剂加入血浆样本中，然后充分混合并在低温条件下静置。蛋白质会沉淀到底部形成沉淀，可以通过离心去除。离心后，小心地去除上清液中的有机溶剂和沉淀。使用吸管或微量吸管，将上清液转移至新的离心管中。最后，通过蒸发浓缩、溶剂萃取或其他适当的方式处理代谢物样本，以去除残余的有机溶剂并使样本适合用于后续的分析方法。在整个制备过程中，应避免任何形式的污染和交叉污染，以确保最终得到高质量的代谢物样本。根据度洛西汀治疗剂量分为低剂量组及高剂量组。本研究经医院医学伦理委员会同意（伦理审批号2021006）。

1.3 纳入与排除标准

纳入标准：①患者符合《精神障碍的诊断与统计手册》[5]中关于MDD 患者的诊断标准，且汉密尔顿抑制量表（Hamilton Inhibition Scale, HAMD-24）评分>20 分；②年龄18～60 岁；③患者首次发作，或复发患者停药≥1 个月；④患者及家属知情并签署知情同意书。

排除标准：①存在严重躯体疾病、神经系统疾病或其他精神障碍患者；②存在严重自杀倾向患者；③心、肝、肾等重要器官存在严重功能障碍患者；④孕妇或哺乳期妇女。

1.4 LC-MS 技术

在液相色谱中，样品通过色谱柱与移动相中的不同组分相互作用，从而实现分离。常用的液相色谱方法包括正相色谱、反相色谱和离子交换色谱等。质谱是一种用于分析样品中化合物结构、组成和质量的方法。在质谱中，化合物首先被电离形成离子，然后通过质谱仪中的质量分析器进行分析。不同离子具有不同的质荷比，可以用于对化合物进行定性和定量分析。在LC-MS 技术中，液相色谱用来实现化合物的分离，质谱用来对分离后的化合物进行检测和分析。样品首先通过液相色谱柱进行分离，然后进入质谱仪中的离子源。在离子源中，样品分子会电离形成离子。离子进入质谱仪中的质量分析器进行分析，得到离子的质荷比信息。最后，离子信号被转化为质谱图，可以用于化合物的定性和定量分析。

1.5 LC-MS 谱分析

色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSST3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流动相：A（0.1%甲酸的水溶液）；B（0.1%甲酸的乙腈溶液），线性梯度洗脱。

质谱条件：电离方式：电喷雾电离（electrospray Ionization, ESI）、大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）等。扫描方式：使用全扫描、选择离子扫描（select ion scanning, SIM）、多反应监测（multiple reaction monitor, MRM）等方式进行数据采集。离子源温度：控制离子源的温度以保证离子化的稳定性。离子源电压：调整离子源电压以保证离子的产生和稳定。离子源气体流量：调整气体流量以维持离子源的稳定。离子源碎裂电压：在需要进行碎裂时，调整碎裂电压以产生碎裂离子。质谱仪解析度：根据分析的需要调整质谱仪的解析度，通常高分辨率可以提供更好的分析效果。

1.6 统计方法

将采集到的数据导入SIEVE 软件包完成谱峰识别、滤噪等前处理[7]，然后导入Excel 中进行峰面积归一化以消除样本之间的差异及仪器所造成的误差。将数据导入SIMCA-P 软件中进行多元统计分析[8-9]，确定与疾病以及药物疗效相关的差异代谢物，并对差异代谢物进行筛选。

2 结果

2.1 治疗后人体血浆代谢物的LC-MS 总离子流图

应用UHPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 分析方法对抑郁症患者逍遥散治疗后血浆样本进行收集，在正、负离子模式下两组人体血浆代谢物的轮廓。见图1、图2。

图1 正离子模式下两组人体血浆代谢物踪总离子流图

图2 负离子模式下治疗前后人体血浆代谢物踪总离子流图

2.2 代表性代谢物的变化

对代谢物的相对峰面积用SPSS 软件进行独立样本t检验，得到19 个与逍遥散抗抑郁疗效相关的潜在生物标志物，见表1。与治疗前相比，逍遥散治疗后抑郁症患者的血浆样本代谢轮廓发生变化，其中出现上调现象的代谢物有环己烷十一酸、溶血性磷酸酰胆碱、氧化磷酸酰胆碱、植物鞘氨醇、神经酰胺，下调现象的是4-羰基 2,3 烯基己二酸、肌酐、硫胱醚、肉碱、乙酰磷酸以及 4-乙酰氨基丁酸。代谢途径主要为甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸酰胺代谢等9 种代谢途径。

表1 经LC-MS 鉴定与逍遥散抗抑郁作用相关的潜在生物标志物

2.3 多元统计分析

采用PCA 对所有样本进行初步分析，对逍遥散治疗抑郁症患者服药前后的样本进行PLS-DA 分析。在正、负离子检测模式下，经过逍遥散治疗后的抑郁症患者血浆样本水平在健康对照组和抑郁症患者中间且趋于正常水平。见图3。

图3 正、负离子模式下两组人体血浆的PLS-DA 散点图

3 讨论

抑郁症是一种常见的心理疾病，常表现为持久的低落情绪、失去兴趣和乐趣以及自我的负面价值观等症状。常用的抗抑郁药物包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs）、三环类抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂（tricyclic antidepressants and monoamine oxidase inhibitors, MAOIs）等。SSRIs 通过抑制5-羟色胺再摄取，增加脑内5-羟色胺浓度，从而提高情绪和心境[10]。三环类抗抑郁药通过抑制去甲肾上腺素和/或去甲肾上腺素、5-羟色胺的再摄取来发挥作用。MAOIs 通过抑制降解神经递质的酶（单胺氧化酶）来增加脑内的去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺浓度。长期抑郁状态也可能导致免疫功能下降、慢性疼痛和心血管疾病等身体健康问题。抑郁症可能导致工作和学习能力下降，影响社交关系，限制日常生活功能[11]。

本研究利用LC-MS 技术进行了逍遥散治疗抑郁症的代谢组学实验研究。通过对逍遥散治疗前后抑郁症患者血浆样本的分析，得到了代谢物谱的变化情况，并进一步研究了逍遥散对抑郁症患者代谢途径的影响。通过LC-MS 分析，本研究鉴定出了19 个与逍遥散抗抑郁疗效相关的潜在生物标志物。这些代谢物涉及甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸酰胺代谢等9 种代谢途径[12]。对比其他研究结果，可以发现逍遥散治疗后抑郁症患者的代谢物谱与正常组的代谢物谱趋于一致。这表明逍遥散治疗可能通过调节甘油磷脂代谢和脂肪酸代谢等代谢途径，来改善抑郁症患者的代谢状态[13]。通过分析血浆代谢物的变化，可以发现逍遥散治疗能够改善抑郁症患者的代谢组学特征[14]。通过LC-MS 技术的代谢组学研究方法可以帮助揭示逍遥散治疗抑郁症的作用机制，为其进一步的临床应用和药物研究提供参考依据。通过分析血浆代谢物的变化，可以发现逍遥散治疗能够改善抑郁症患者的代谢组学特征[15]。具体地，逍遥散治疗组的芳香化合物、氨基酸和脂类代谢发生了显著变化。这些代谢物在抑郁症的发生和发展中起着重要的作用，与逍遥散的治疗效果密切相关。在其他研究中，利用相同的LC-MS 技术研究了另一种中药对抑郁症的治疗效果。该研究发现，中药治疗后抑郁症患者的代谢物谱中也出现了一系列与甘油磷脂代谢和脂肪酸代谢相关的代谢物。其中，特别是三酰甘油水平的显著提高与逍遥散相似。此外，采用多元统计分析方法可以对样本进行分类和降维处理，帮助区分逍遥散治疗组和健康对照组之间的差异。LC-MS 技术在代谢组学研究中具有高分辨率、高灵敏度和高通量等优势，可以实现代谢物的定性和定量分析。

综上所述，逍遥散治疗抑郁症可以通过调节甘油磷脂代谢和脂肪酸代谢等代谢途径来发挥作用。这与其他研究中的结果相符合，进一步支持了逍遥散作为抑郁症治疗的潜在机制。然而，还需要更多的研究来验证这些代谢变化与抑郁症症状的关联，并进一步探讨逍遥散治疗的分子机制。