模拟增温对木荷叶际抗生素抗性基因的影响

林小如,李子歆,孙安琪,金圣圣,徐超蝶,陈仕东,2,刘小飞,2,沈菊培*

模拟增温对木荷叶际抗生素抗性基因的影响

林小如1,李子歆1,孙安琪1,金圣圣1,徐超蝶1,陈仕东1,2,刘小飞1,2,沈菊培1*

(1.福建师范大学湿润亚热带山地生态国家重点实验室培育基地,福建师范大学地理科学学院/碳中和未来技术学院,福建 福州 350007；2.福建三明森林生态系统国家野外科学观测研究站,福建 三明 365002)

为探究增温对叶际抗生素抗性基因(ARGs)分布的影响及其季节变化特征,本研究在夏季、秋季和冬季3个季节采集木荷叶片样品,设置对照(土壤不增温)与增温(土壤增温4℃)两个处理,采用高通量荧光定量PCR技术测定叶际ARGs的种类及相对丰度.结果表明:在所有叶际样品中共检测到255种ARGs和10种MGEs,其中多重耐药类是叶际优势抗生素抗性基因类型,相对丰度占总体的47.4%,而抗生素外排泵为主要抗性机制.方差分析和主坐标分析表明季节对叶际抗性基因的分布有显著影响,秋季和冬季叶际ARGs的相对丰度分别为(0.614±0.303)拷贝/16S rRNA和(0.589±0.218)拷贝/16S rRNA,高于夏季((0.291±0.101)拷贝/16S rRNA),且ARGs多样性同样表现为秋冬季高于夏季.研究检测到7种抗性基因(2-03-02-01-01-02)的相对丰度在增温处理中显著下降(<0.05),而仅有-01基因相对丰度显著上升(<0.05).冗余分析和结构方程模型显示,季节通过改变土壤理化性质间接影响叶际ARGs的分布,而增温对其没有产生显著影响.

抗生素抗性基因；季节变化；植物叶际；全球气候变化

抗生素的发现和使用对提高人类健康和寿命有非常重要的作用,但近年来由于其在医疗、畜牧养殖中的滥用,导致大量抗生素耐药菌的出现,引起社会对抗生素及抗生素抗性基因(ARGs)的重视和关注[1-2].由于微生物的内在抗性,土壤环境中本身就存在大量ARGs[3].通过对我国跨域近4000km天然森林生态系统的调查发现[4],森林土壤中存在8个大类共计160余种ARGs,且ARGs多样性与草本植物多样性、细菌多样性及可移动遗传元件(MGEs)多样性显著相关.另外,环境中的ARGs可借助MGEs,如质粒、整合子、转座子等在同种甚至不同种细菌之间实现水平基因转移(HGT),从而加快了ARGs的传播和扩散,对环境和人体健康产生潜在的危害,故ARGs被认为是一种新型的生物污染物[5].因此,认识和探究ARGs的分布及其对环境变化的响应对保护生态环境和人类健康具有重要作用.

叶际由植物地上部分组成,以叶片为主[6].据估计,全球植物叶表面积达108km2,每km2包含细菌数量超过1016[6-7].叶际微生物是环境中ARGs的重要储存库[3,8-9].通过对比分析不同来源的生菜叶片ARGs[10],共检测到134种ARGs和6种MGEs,其绝对拷贝数达1.76×108.叶际是一个相对开放的生境,与土壤、大气等外界环境紧密联系.携带ARGs的土壤微生物可通过根内-叶内-叶际的植物体内途径进行转移,也能借助大气气溶胶以植物体外迁移途径到达叶表[11-12].同时,宿主植物周围的环境因子,包括温度、太阳辐射、湿度、土壤类型等非生物因素,以及植物种类和基因型、对资源分泌物(如初级和次级代谢产物)的适应性等生物因素,也会影响叶际微生物的组成[6,13].例如,植物叶片在生长过程会释放挥发性有机物(VOCs),其中萜烯类VOCs具有抗菌作用,可能会抑制叶际细菌活性[14-15].微生物群落结构是ARGs组成的决定因素,因此环境因子会通过叶际微生物对叶际ARGs产生影响.由此可见,叶际ARGs种类丰富,相对丰度高,且易受外界环境的影响,具有潜在的风险[9].目前已有大量的研究报道农作物叶际ARGs的赋存情况,但对受人类影响较小的森林生态系统树木叶际ARGs的分布还知之甚少[8].

据IPCC预计到21世纪末,全球平均气温将上升2.6～4.8 ℃[16].气候变暖作为全球气候变化的一个主要特征,对元素循环和陆地生态系统的功能产生重要影响[17],进而改变植物群落组成和叶际微生物组[13].一方面,增温会改变植物根系营养吸收状况,影响叶际微生物组成,使其携带的ARGs可能发生改变.另一方面,增温会直接影响微生物的生长速率和群落结构[18-19],提高水平基因转移风险[20].因此,增温会直接或间接地影响叶际ARGs 组成.有研究发现土壤增温4℃将导致部分天然林和人工林土壤ARGs相对丰度显著增加[21].另有研究采用黄河水进行室内培养,发现ARGs的丰度随着温度升高而增加[22].然而,目前仅有关于增温对土壤和水体ARGs影响的研究[21-22],却鲜有关注增温对叶际ARGs多样性和丰度的报道.除了温度外,季节变化也被认为是影响叶际微生物群落结构的重要因素[23-24].因此,研究季节变化对ARGs的影响,可以更加全面地了解增温背景下抗生素抗性组的分布和变化特征.

亚热带森林是我国典型的森林生态系统,具有重要的生态系统服务功能,对全球变暖的响应十分敏感[25].木荷()作为亚热带常绿阔叶林中分布最为广泛的优势树种之一,具有重要生态和经济价值,在我国南方林业和亚热带森林生态系统中占有重要地位.因此,本文依托福建省三明市长期土壤增温实验平台,以亚热带天然林木荷叶片为研究对象,运用高通量荧光定量PCR技术分析增温对叶际ARGs丰度和多样性的影响及季节变化特征,同时分析环境因子对ARGs组成的影响,为阐明气候变暖情景下环境ARGs的传播扩散机制提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 研究地概况与实验设计

试验区位于福建三明森林生态系统国家野外科学观测研究站的格氏栲天然林增温平台(26˚9΄～26˚12΄N,117˚27΄～117˚29΄E).该地区地貌以低山丘陵为主,海拔250～500m,属中亚热带型季风气候,年均温19.5 ℃,年均降水量1700mm.增温平台试验地的相对湿度为81%.研究区内以黄岗岩发育的黄壤和红壤为主.植被类型属亚热带常绿阔叶林,主要为格氏栲(),其他树种包括米槠()、木姜子()、木荷()、杜英()等.

研究于2014年10月在格氏栲天然林随机设置10个6m×6m的试验样地,设增温(+4 ℃)和对照(不增温)两种处理,每种处理5个重复.土壤增温处理,在样地地面以下10cm处铺设平行电缆进行加热,相邻电缆的距离为20cm[21].同时在每个样地布设多个温度和湿度传感器来监测不同土层的土壤温、湿度的变化.增温平台样地于2015年10月开始增温,期间尽量减少外来扰动对土壤的影响.

1.2 样品采集与处理

分别于2019年7月(夏季)、2019年10月(秋季)、2020年1月(冬季)在每个样地中采集叶际与土壤样品.每个样地随机选取几棵长势一致的木荷,在同一高度处(距地面1.4～1.6m,避免高度过低受到土壤影响),剪取20g成熟叶片放入自封袋中[26],同一样地叶片混合为一个叶际样品.同时,每个样地用直径5cm的土芯取样器随机取5点采集0～15cm的表层土壤,同一样地的5份土壤混合成一个土样.叶际样品和土壤样品均在冰盒中运送至实验室.叶际样品保存于-20℃的冰箱用于DNA提取.土壤样品过 2mm筛,4℃保存用于理化性质分析.

1.3 土壤理化性质测定

土壤含水量用烘干法测定.土壤pH值(土水比为1:5)用pH计(FE20Mettler Toledo,德国)测定.土壤铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)用2mol/L的KCl进行浸提(土水比为1:4),振荡离心后通过0.45 μm滤膜用连续流动分析仪(Skalar San++,荷兰Skalar)测定.土壤微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法,再分别用总有机碳分析仪(TOC-VCPH/CPN,日本Shimadzu)和连续流动分析仪(Skalar San++,荷兰Skalar)测定.土壤总氮(TN)和总碳(TC)使用碳氮元素分析仪(Vario MAX C / N,德国Elementar)测定.土壤可溶性有机碳(DOC)和可溶性有机氮(DON)用去离子水(土水比为1:4)浸提,分别用总有机碳分析仪(TOC-VCPH/CPN,日本Shimadzu)和连续流动分析仪(Skalar San++,荷兰Skalar)测定.土壤理化性质的详细信息见表1[21].

1.4 叶际DNA提取

将5g木荷叶片剪碎后置入250mL锥形瓶,加入100mL灭菌磷酸缓冲盐溶液,超声5min,然后置于摇床中180r/min振荡1h后取出[10].用灭菌纱布过滤出植物组织,滤液全部通过0.22 μm滤膜.剪碎滤膜后用FastDNA Spin试剂盒(美国MP Biomedicals)提取植物叶际 DNA,并用紫外分光光度计ND-1000测定DNA浓度及纯度,储存于-20℃冰箱备用.

1.5 ARGs与MGEs的高通量荧光定量PCR分析

利用WaferGen SmartChip Real-time PCR Systems高通量荧光定量PCR分析平台测定天然林叶际微生物所携带的ARGs与MGEs多样性(即检测到的靶基因数目)和丰度.PCR过程中设置296对引物,包括285个环境中广泛存在的ARGs(涵盖9类常见抗生素:氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素类、大环内酯-林可酰胺-链阳霉素B类、磺胺类、四环素类、万古霉素类、多重耐药类和其他类)、10个MGEs基因(2个整合子基因、8个转座子基因)和1个16S rRNA基因.WaferGen平台一次可进行5184个反应,每个PCR反应100nL.PCR反应体系为: 25μL TB Green Premix Ex TaqII,前后引物各0.4μL, DNA模板1μL,RNA-free water 0.7μL.热循环过程: 95℃预变性10min;95℃变性30s,60℃退火延30s,共40个循环.T值为PCR反应的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数.根据仪器的检测限和灵敏度,设置T值的检测阈值为31.每个样品包含3个技术重复,3次重复T值均小于31时认为是阳性扩增.

采用2-∆CT法计算每个样品中ARGs和MGEs的相对丰度,其中ΔT=(T detected ARGs-T 16S rRNA gene)[27].

1.6 数据分析与绘图

采用重复测量方差分析以探究季节和增温处理及其交互作用对叶际ARGs的影响.利用单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较检验不同季节及各处理之间ARGs的差异.利用Levene′s法检验方差齐性,方差齐性时使用邓肯法进行多重比较,方差不齐时则使用塔姆黑尼T2进行多重比较.使用独立样本检验分析增温处理对于ARGs亚型的影响.上述统计检验均在SPSS 26中进行.冗余分析(RDA)和主坐标分析(PCoA)分别采用R 4.2.2的vegan软件包的rda函数和pcoa函数进行.结构方程模型(SEM)使用AMOS 25 生成,其中数据包括增温处理(设置为种类变量,对照处理为0,增温处理为1)、季节因素(采用采样月平均温度)、土壤理化性质(选取10个土壤理化性质指标的主坐标分析第一主成分作为结构方程模型分析数据)、MGEs及ARGs的相对丰度.合格模型需满足以下标准:(1)非显著性2检验:>0.05;(2)近似误差均方根RMSEA<0.08;(3)拟合优度指数GFI>0.9;(4)比较拟合指数CFI>0.9.应用Origin 2021绘制饼图、柱状图与箱线图,采用R 4.2.2进行主坐标分析和冗余分析可视化.

表1 不同处理土壤基本理化性质和月平均温度的季节差异[21]

2 结果与分析

2.1　叶际ARGs和MGEs多样性和丰度

采用高通量定量PCR技术,在木荷叶际样品中共检测到255种ARGs和10种MGEs,表明ARGs在受人类干扰较少的自然环境中广泛存在.如图1(a)所示,各样本中检测到的ARGs数量范围为77～115种,其中多重耐药类(48种)和β-内酰胺类(47种)的数量最多,其他数量较高的ARGs包括MLSB类(42种)、氨基糖苷类(32种).在相对丰度组成方面,9类ARGs中相对丰度占比较高的为多重耐药类(47.4%)、β-内酰胺类(20.3%)和氨基糖苷类(11.8%)(图1b),表明多重耐药类ARGs为叶际优势ARGs类型.ARGs主要抗性机制包括:抗生素失活机制(104种)、抗生素外排泵机制(78种)、细胞核糖体保护机制(64种),其中抗生素外排泵的相对丰度最高(52.8%)(图1c,d),在ARGs的抗性机制中占主导地位,其次为抗生素失活机制(35.6%).

图1 不同种类的ARGs多样性、相对丰度占比和不同抗生素抗性机制的多样性、相对丰度占比

ARGs在环境中的转移主要由MGEs介导.在检测到的10种MGEs中,包含2个整合子基因()和8个转座子基因().整合子基因的相对丰度占比达97%,其次为整合子基因(2%),这表明基因在MGEs中具有绝对优势地位.

2.2 不同季节与增温处理对于 ARGs 与 MGEs 多样性及丰度的影响

总体上看,冬季木荷叶际ARGs数量显著高于夏季(0.05),秋季和冬季ARGs相对丰度显著高于夏季(0.05),而MGEs数量和相对丰度在不同季节间均无显著差异(0.05)(图2),说明季节对ARGs的影响较大.同一季节不同处理间,秋季增温ARGs相对丰度显著低于对照(0.05),而夏季MGEs数量则表现为增温显著高于对照(0.05).

图2 不同季节与处理叶际中ARGs和MGEs的多样性、相对丰度

表2 重复测量方差分析季节、增温对ARGs和MGEs的多样性和相对丰度的影响

注:表中加粗数字和*表示<0.05.

具体来说,对照处理叶际磺胺类ARGs数量、万古霉素类ARGs相对丰度及整合子类MGEs数量均表现为秋季显著高于夏季(<0.05),-内酰胺类ARGs相对丰度为冬季显著高于夏季(<0.05).而增温处理叶际氨基糖苷类ARGs数量冬季显著高于夏季和秋季(0.05),整合子类MGEs数量在夏季和冬季显著高于秋季(0.05).大部分ARGs的数量和相对丰度在同一季节不同处理间无显著差异(>0.05),仅秋季四环素类ARGs相对丰度的增温显著低于对照(<0.05).在MGEs中,夏季整合子类数量的增温显著高于对照(<0.05),但其秋季的增温显著低于对照(<0.05).这意味着增温对MGEs的作用会受到季节影响.

重复测量方差分析结果显示,季节对ARGs数量和相对丰度产生了显著影响(<0.05),而增温对MGEs数量有显著影响(<0.05)(表2).另外,季节与增温的交互作用对ARGs及MGEs的数量和相对丰度均无显著影响(>0.05).基于ARGs相对丰度进行主坐标分析(PCoA)(图3),结果发现主成分PC1和PC2对ARGs分布变异的解释分别为25.6%和12.8%.从图中可以看出不同季节叶际ARGs有明显差异(Adonis test,<0.001),主要表现在夏季和其他两个季节间的差异,而对照和增温处理之间则差异不显著(Adonis test,>0.05).

进一步对所有 ARGs 亚型的相对丰度进行独立样本t检验,发现8 种ARGs在对照和增温处理之间相对丰度差异显著(<0.05),表明其对温度变化较为敏感(图4).这8种ARGs亚型分别属于多重耐药类、氨基糖苷类、MLSB类和四环素类.其中,仅在增温处理下显著富集(<0.05),其余7种 ARGs亚型(包括)的相对丰度则在增温处理下显著下降(<0.05),说明增温对不同种类ARGs的影响存在差异.

图3 基于Bray-Curtis距离的不同季节和处理的ARGs主坐标分析

三角形为增温处理,正方形为对照

图4 对温度敏感的叶际ARGs亚型的对照和增温处理的相对丰度

2.3 环境因子对ARGs的影响

为探究不同因子对木荷叶际ARGs的影响,本文将土壤理化性质、MGEs、月平均温度与ARGs相对丰度进行spearman相关性分析.结果表明总ARGs数量、总ARGs相对丰度与DOC分别呈显著(<0.05)和极显著正相关(<0.01),而总ARGs数量、总ARGs相对丰度与SMC、DON、MBN、MMT呈显著(<0.05)或极显著负相关(<0.01)(表3),并分别与MBC、pH值呈极显著负相关(<0.01).这意味着总ARGs数量和相对丰度受到多种环境因子的影响.不同季节中,夏季ARGs相对丰度与pH值呈显著负相关(<0.05).秋季、冬季ARGs数量与DON呈显著(<0.05)和极显著负相关(<0.01).冬季ARGs相对丰度与铵态氮、硝态氮、TN和TC显著正相关(<0.05).说明不同季节ARGs的主要影响因子不同.在所有环境因子中,仅MGEs与ARGs各种指标均无显著关系,可能是因为季节对MGEs的影响不显著.

选取主要土壤性质、月平均温度和MGEs与ARGs相对丰度进行冗余分析.由图5可得,第1和第2排序轴分别解释了叶际ARGs组成分布差异的25.77%和17.91%.夏季ARGs与秋季、冬季ARGs沿第1排序轴明显分开.影响ARGs组成的主要环境因子为DON、DOC、MBN和MMT,而pH值、MGEs和铵态氮的影响较小.

表3 ARGs数量、相对丰度与环境因子的spearman相关系数

注: * 和加粗数字表示<0.05, ** 表示<0.01.

图5 环境因子与ARGs的冗余分析

三角形表示增温处理,正方形为对照

采用结构方程模型进一步解释季节、增温处理、土壤理化性质与MGEs对ARGs作用的效应(图6).为了降低模型的复杂性,使用2001～2019年三明1月、7月和10月的月平均温度(分别为10 ,29 ,22 ℃)代表季节因子,且对土壤理化性质进行主坐标分析并提取第一主成分作为SEM分析的土壤理化性质数据.土壤理化性质第一主成分解释总变异的48.29%,因此提取的变量能较好地反映相关数据的贡献.最终SEM解释了叶际ARGs变化的29.2%.通过模型计算和评估,结果显示模型参数为= 1.00,GFI = 1.00,CFI = 1.00,RMSEA = 0.00,表明所建的结构方程模型较为可靠.在4个环境因子中,对 ARGs 影响最大的因素为季节因素,对ARGs具有间接的负效应.其次为土壤理化性质,对ARGs的影响主要为直接正效应.模型的所有路径中仅季节因素对土壤理化性质具有极显著负作用(<0.01),其余路径作用效果不显著.这意味着季节因素可能通过土壤理化性质而间接影响叶际ARGs组成.MGEs对ARGs的影响为直接正效应.增温处理对ARGs的影响为直接负效应,与月平均温度和总ARGs数量、相对丰度呈极显著负相关一致.

图6 结构方程模型解析不同因子对ARGs分布的影响

虚线箭头表示路径系数为正, 实线箭头表示路径系数为负, *表示路径系数显著(<0.05)

3 讨论

3.1 叶际ARGs的多样性和相对丰度

以往关于土壤-植物系统的研究发现土壤比叶际含有更丰富的ARGs和MGEs种类[11,28–30],而在本研究亚热带天然林木荷叶际上检测到255种ARGs和10种MGEs,说明亚热带天然林中叶际ARGs的多样性比土壤丰富[21].Do等[31]同样发现草地植物叶际ARGs、MGEs和细菌多样性比土壤高,表明叶际ARGs组成受多种因子的影响[12].本研究叶片采集高度为1.4～1.6m之间,取成熟的中间层叶片,采样部位能有效避免来自土壤颗粒的影响.此外,有学者认为在贫营养环境中,微生物是通过释放抗生素裂解敏感菌株而获得到营养,为生存提供了物质[32].植物叶际生存条件苛刻,叶际微生物不仅面临水分、营养物质不足、剧烈变化的强光、高温和高紫外线照射等问题,还要面对植物或其他微生物产生的抗菌物质[6].因此,叶际微生物在恶劣的叶际环境会释放更多的抗生素,增加环境对ARGs的选择压力,导致叶际ARGs多样性较高.本研究中,叶际ARGs的优势抗性基因种类为多重耐药类,这与已有研究一致[12,33-34].需要注意的是,携带多重耐药类基因的微生物会对多种抗生素产生耐药性从而成为超级细菌,对人类健康造成严重威胁.在抗性机制方面,抗生素外排泵类和抗生素失活类的ARGs(共计88.4%)占主导地位,这可能是因为外排泵在排除抗生素的同时排出重金属和其他有毒分子,从而有助于微生物更好地适应不利环境条件[35].在大多数情况下,它是土壤中主要的抗性机制[12],而抗生素失活机制是细菌通过对抗生素的降解或取代活性基团来改变抗生素的结构,使抗生素失活.其中,产β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素失活是细菌耐药的最常见和最重要的机制,而在本研究中β-内酰胺类ARGs相对丰度占比达20.3%的研究结果也佐证了以上推测.已在各种环境中被频繁检出,人类活动(如医院污水、工业污染等)可导致大量的释放,因此与人类活动紧密相关[36-37].本文发现基因丰度占所测的10种MGE的97%,这意味天然林植被ARGs具有较高的传播潜力[8].在One Health视角下,不仅要制定防止ARGs在人类活动场所中传播的对策,还需要研究控制抗性基因在野外传播扩散的措施,这对人类和动物的健康具有重要影响[3,38].

3.2 增温对ARGs分布的影响

随着抗生素耐药性问题的日渐严重及全球气候的持续变化,人们越来越关注这两个全球性问题之间的潜在联系.已有研究发现气温升高与人类常见病原体的抗生素耐药性上升和抗生素耐药率增加相关[39-40].然而本研究发现,增温对叶际总ARGs的多样性和相对丰度无显著影响,但月平均温度与总ARGs数量和相对丰度呈极显著负相关.这可能是因为叶际温度主要受大气温度影响[41],土壤增温对植物叶际ARGs的直接影响较小.研究中增温对MGEs数量有显著影响,ARGs与MGEs并无显著相关.这表明增温并未通过影响MGEs进而影响ARGs.本文前期关于增温对土壤ARGs和MGEs的研究中也得到类似的结果[21].同时,发现不同种类ARGs对温度的响应不同.大部分ARGs亚型的对照与增温处理间无显著差异.在检测到的255种ARGs中,仅7 种 ARGs亚型(包括和)的相对丰度在增温处理下显著降低,基因则在增温处理下显著富集.Yu等[22]和Yang等[42]通过宏基因组测序技术探究黄河水ARGs对系列温度梯度(23,26,29,32,35℃)的响应,同样发现少量ARGs和MGEs对温度变化较为敏感,但增温会导致某些高风险ARGs丰度上升.Li等[21]前期研究也发现增温使8种天然林土壤ARGs亚型的相对丰度显著上升.这可归因于携带ARG微生物的热敏感性不同.增温会导致更适应环境变化的细菌类群数量增多[19],或影响细胞膜的通透性,使蛋白质结构变性和代谢酶失活,导致一些敏感微生物无法生存[22],从而改变叶际细菌群落组成.亚热带木荷叶际细菌门水平上,变形菌门、酸杆菌门、放线菌门和浮霉菌门的丰度较高[43],且研究表明增温处理导致放线菌门的相对丰度显著增加,变形菌门的相对丰度显著减少[19].因此在木荷叶际中,增温可能通过改变不同类型ARGs宿主菌丰度使相应ARGs的丰度上升或下降.必须注意的是,叶际微生物中人类病原体、动物寄生虫或共生体等功能分组的相对丰度则在增温处理下显著增加[19].这将增加ARGs进入人类或动物致病菌的风险,所以我们仍然不可忽视增温条件下ARGs对人类健康的影响.尽管已有一些研究发现增温会影响树木叶片生理特征,进而影响叶际微生物,而对ARGs产生潜在的影响[44-46],然而,迄今尚缺乏直接证据证明增温可以通过影响宿主植物的生理状态而间接影响叶际ARGs的组成,相关内容有待未来进一步研究.总之,温度对于ARGs的作用是一个复杂的过程,具体影响机制还需要深入研究和探讨,以便更好应对全球变暖情境下的抗生素耐药问题.

3.3 季节对ARGs的影响

方差分析和PCoA结果表明,叶际ARGs的组成具有季节性差异,具体表现为冬季和秋季ARGs的多样性和相对丰度高于夏季.微生物群落结构是ARGs组成变化的重要驱动因素,叶际ARGs的季节差异性可能源于植物叶际微生物群落结构的季节动态变化[23-24].这种季节动态受到温度、太阳辐射、水分可利用性等环境因素,与植物生长过程中产生的碳水化合物、有机酸、挥发性有机物等影响[6,41,47]. Peñuelas等[48]报道,在地中海夏季恶劣环境条件下,叶际细菌和真菌群落的丰富度和均匀度低于春季.研究发现木荷枝叶VOCs以萜烯类化合物为主,秋季的萜烯类化合物的总相对含量较低[49].因此,夏季较高的温度与释放较多的萜烯类VOCs,可能导致叶际细菌多样性下降,降低了夏季叶际的ARGs多样性和相对丰度.

除生物因素外ARGs 也会受到环境因子的直接影响.例如水库中的 ARGs 的丰度和总基因拷贝数与水质富营养元素TN,TP,TOC和重金属含量显著相关[50-51].土壤的盐浓度,pH 值以及营养状况的改变会使细菌群落发生变化并且进一步影响抗生素耐药性[52-53].Li等[21]利用随机森林模型发现DOC和铵态氮是预测土壤ARGs组成变化主要的非生物因子.本研究也发现,总ARGs数量和相对丰度与多个土壤理化指标显著相关,且冗余分析表明DON、DOC和MBN是主要预测因子.当环境因素季节变化将会导致ARGs的季节性变化[54].本研究中,夏季ARGs相对丰度与pH值呈显著负相关,而秋冬季ARGs数量与DOC呈显著负相关.且冬季ARGs相对丰度与铵态氮、硝态氮、TC和TN呈显著正相关.可能是因为夏季ARGs受到pH值影响,而秋冬季ARGs受到养分因子限制.贾世杰等[55]同样发现不同季节影响ARGs的主导环境因子不同,风速和温度是影响冬季气溶胶ARGs组成最重要的因素,春季气溶胶中ARGs的分布则主要受到温度和湿度的影响.结构方程模型进一步证明季节因素通过改变土壤环境因子而对叶际ARGs产生间接影响.

因此,季节变化可以通过生物和非生物等多种途径对ARGs产生直接或间接的影响,使得ARGs呈现季节动态变化.本研究结果表明,冬季木荷叶际ARGs多样性和相对丰度较高.Sun等[56]研究发现冬季是人们大量使用抗生素如青霉素类和大环内酯类的季节高峰.因此,冬季环境中较高的ARGs多样性和丰度可能会削减临床上抗生素的治疗效果,是人类健康的重大隐患.全球气候变化将会影响四季更替,这可能会对植物微生物群落的组成以及植物抗性组产生重大影响[57].故需深入研究增温背景下叶际ARGs的季节变化,为缓解全球耐药问题提供更多信息.

4 结论

4.1 在天然林木荷叶际中检测到255种ARGs和10种MGEs,其中多重耐药类为优势ARGs类型(相对丰度占比47.4%),抗生素外排泵为主要抗性机制(相对丰度占比52.8%).MGEs中占据绝对优势地位(相对丰度占比97%).ARGs与MGEs之间无显著相关(>0.05).

4.2 木荷叶际ARGs的组成具有季节性差异,表现为ARGs多样性和相对丰度在秋季(93.5种,0.614±0.303拷贝/16S rRNA)、冬季(101.4种,(0.589±0.218)拷贝/16S rRNA)较夏季(87.2种,(0.291±0.101)拷贝/ 16S rRNA)高.季节因子主要通过改变土壤理化性质(DON、DOC、MBN)间接影响叶际ARGs的组成.

4.3 增温导致acrA-01基因相对丰度显著上升(<0.05),7种抗性基因(2-03、-02、、/、-01、-01、-02)的相对丰度显著下降(<0.05).

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Effect of stimulated warming on phyllosphere antibiotic resistance genes of.

LIN Xiao-ru1, LI Zi-xin1, SUN An-qi1, JIN Sheng-sheng1, XU Chao-die1, CHEN Shi-dong1,2, LIU Xiao-fei1,2, SHEN Ju-pei1*

(1.State Key Laboratory for Subtropical Mountain Ecology of the Ministry of Science and Technology and Fujian Province, School of Geographical Sciences/School of Carbon Neutrality Future Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China；2.Fujian Sanming Forest Ecosystem National Observation and Research Station, Sanming 365002, China)., 2023,43(12)：6689～6699

To understand the effect of warming on the distribution and seasonal dynamics of antibiotic resistance genes (ARGs) in the phyllosphere, we conducted a study involving collection of foliar samples from natural forest leaves during summer, autumn and winter from two treatments: control and warming (+4℃). The numbers and relative abundance of ARGs in the phyllosphere were determined by high-throughput quantitative PCR. Results showed that a total of 255 ARGs and 10 MGEs were detected in all phyllosphere samples, among which multidrug resistance was the dominant gene type in the phyllosphere, accounting for 47.4% of the total. The antibiotic efflux pump was the main resistance mechanism. ANOVA analysis and principal coordinate analysis showed that season significantly influenced the distribution of phyllosphere ARGs. The relative abundance of phyllosphere ARGs in autumn and winter was (0.614 ± 0.303)copies/16S rRNA and (0.589 ± 0.218)copies/16S rRNA, respectively, which was higher than that in summer ((0.291 ± 0.101)copies/16S rRNA), and the diversity of ARGs in autumn and winter was also higher than that in summer. We found that the relative abundance of seven ARGs(2-03,-02,,/,-01,-01,-02) decreased significantly (<0.05), while the relative abundance of the-gene increased significantly (<0.05) in the warming treatment. Redundancy analysis and structural equation modeling showed that seasonality was the main factor driving the composition of phyllosphere ARGs via mediating soil physicochemical properties, while warming had no significant effect.

antibiotic resistance genes；seasonal variation；plant phyllosphere；global climate change

X713

A

1000-6923(2023)12-6689-11

林小如,李子歆,孙安琪,等.模拟增温对木荷叶际抗生素抗性基因的影响 [J]. 中国环境科学, 2023,43(12):6689-6699.

Lin X R, Li Z X, Sun A Q, et al. Effect of stimulated warming on phyllosphere antibiotic resistance genes of[J]. China Environmental Science, 2023,43(12):6689-6699.

2023-04-15

福建省自然科学基金资助项目(2022J02026);福建省“闽江学者奖励计划”项目(2021)

* 责任作者, 研究员, Jpshen@fjnu.edu.cn

林小如(2001-),女,广东潮州人,福建师范大学本科生,研究方向为微生物生态学.linxiaoru0310@foxmail.com.