松萝酸对增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为及JNK/MAPK信号通路的影响

王晓妮, 郭 涛, 罗启云, 关立锋

（宁夏医科大学总医院烧伤整形美容科，宁夏 银川 750004）

增生性瘢痕是皮肤发生损伤后出现的病理性改变，在细菌感染和过度炎症反应等因素的调控下，增生性瘢痕成纤维细胞 （hypertrophic scar fibroblasts，HSFBs） 大量增殖，胶原合成与分解平衡被打破，细胞外基质大量沉积，从而造成瘢痕增生，影响患者美观程度，严重者会并发局部溃烂甚至癌变，给患者带来巨大的心理压力和精神痛苦［1-3］。松萝酸具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多种药理学活性，可促进创面愈合和控制创面瘢痕过度增生［4-6］。松萝酸可抑制兔耳增生性瘢痕内血管生成，从而抑制增生性瘢痕的形成［7］。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亚族，JNK 相关信号通路在细胞增殖、分化和凋亡过程中具有重要作用［8］。研究［9］显示：A 型肉毒素通过激活JNK 信号通路可诱导成纤维细胞凋亡和抑制成纤维细胞增殖。松萝酸在创面愈合过程中对病理性瘢痕形成的影响和JNK 信号通路的作用尚未完全阐明。本研究探讨松萝酸对HSFBs增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，阐明其对JNK/MAPK 信号通路的调节作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器HSFBs 购自美国ATCC 公司。松萝酸（纯度>98%） 购自美国Sigma 公司， 噻唑蓝 （methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，DMEM 培养基和胎牛血清购自美国Gibco 公司，磷酸化JNK （phosphorylated JNK，p-JNK）、JNK、B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 和GAPDH 抗体购自美国Abcam 公司。CytoFLEX 型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter 公司，680 型全自动酶标仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 细胞培养和实验分组将HSFBs 培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，光学显微镜下观察细胞融合度，待细胞融合度达80%以上时进行细胞传代。取第4 代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，以每孔2×103个细胞的密度接种于96 孔细胞培养板，置于培养箱中培养，细胞贴壁生长后，将细胞分为对照组、10 μmol·L－1松萝酸组、20 μmol·L－1松萝酸组和50 μmol·L－1松萝酸组，对照组细胞更换新鲜培养液，各浓度松萝酸组细胞更换含不同浓度松萝酸培养液，培养24 h 后用于实验。

1.3 MTT 法检测各组细胞存活率取各组处理后细胞，每孔加入10 μL 0.5 g·L－1MTT 溶液继续孵育4 h，加入200 μL 二甲基亚砜，培养箱中孵育15 min，采用酶标仪于波长490 nm 处测定吸光度（A）值，计算各组细胞存活率。细胞存活率=（实验组A 值－空白组A 值）/（对照组A 值－空白组A 值）×100%。

1.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡率取各组处理后细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 次，加入500 μL PBS 结合缓冲液重悬细胞，分别加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和PI，轻轻震荡混匀，室温下避光孵育10 min，流式细胞仪检测凋亡细胞数，计算各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.5 Transwell 小室实验检测细胞侵袭和迁移能力取各组处理后细胞，将Matrigel 与DMEM 培养基按1∶9 稀释，Transwell 小室中加入稀释后基质胶，培养箱中静置30 min。将细胞制成1×105mL－1细胞悬液，取100 μL 细胞悬液置于Transwell 小室的上室中，Transwell 小室的下室中加入500 μL含5%胎牛血清的DMEM 培养基，培养箱中培养24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS 缓冲液清洗，显微镜下观察并拍照，计数各组侵袭细胞数。另取处理后细胞，除上室中不加Matrigel 外，其余操作步骤同上。结晶紫染色后，显微镜下观察并拍照，并计数各组迁移细胞数。以侵袭和迁移细胞数代表各组细胞侵袭和迁移能力。

1.6 Western blotting 法检测细胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平取各组处理后细胞，裂解液裂解，离心取上清液，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，取蛋白25 μg 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白质，并转移至PVDF 膜上，室温封闭1 h，一抗p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶5 000） 室温孵育2 h，ECL 法显色，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.7 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞存活率、细胞凋亡率、迁移和侵袭细胞数及细胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax蛋白表达水平均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞存活率和细胞凋亡率与对照组比较，10、20 和50 μmol·L－1松萝酸组细胞存活率均降低（P<0.05），细胞凋亡率均升高（P<0.05）。与10 μmol·L－1松萝酸组比较，20 和50 μmol·L－1松萝酸组细胞存活率均降低（P<0.05），细胞凋亡率均升高（P<0.05）。与20 μmol·L－1松萝酸组比较，50 μmol·L－1松萝酸组细胞存活率降低（P<0.05），细胞凋亡率升高（P<0.05）。见图1 和表1。

表1 各组细胞存活率和细胞凋亡率Tab. 1 Survival rates and apoptotic rates of cells in various groups（n=3，x±s，η/%）

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig. 1 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.2 各组侵袭细胞数与对照组比较，10、20 和50 μmol·L－1松萝酸组侵袭细胞数均减少（P<0.05）。与10 μmol·L－1松萝酸组比较， 20 和50 μmol·L－1松萝酸组侵袭细胞数均减少（P<0.05）。与20 μmol·L－1松萝酸组比较，50 μmol·L－1松萝酸组侵袭细胞数减少（P<0.05）。见图2和表2。

表2 各组侵袭细胞数和迁移细胞数Tab. 2 Numbers of invasion cells and migration cells in various groups（n=3，±s）

表2 各组侵袭细胞数和迁移细胞数Tab. 2 Numbers of invasion cells and migration cells in various groups（n=3，±s）

*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with 10 μmol·L－1 usnic acid group； #P<0.05 compared with 20 μmol·L－1 usnic acid group.

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图2 结晶紫染色观察各组侵袭细胞数（×400）Fig. 2 Number of invasion cells in various groups observed by crystal violet staining(×400)

2.3 各组迁移细胞数与对照组比较，10、20 和50 μmol·L－1松萝酸组迁移细胞数均减少（P<0.05）。与10 μ mol·L－1松萝酸组比较， 20 和50 μmol·L－1松萝酸组迁移细胞数均减少（P<0.05）。与20 μmol·L－1松萝酸组比较，50 μmol·L－1松萝酸组迁移细胞数减少（P<0.05）。见图3 和表2。

图3 结晶紫染色观察各组迁移细胞数（×400）Fig. 3 Number of migration cells in various groups observed by crystal violet staining(×400)

2.4 各组细胞中JNK、p-JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平与对照组比较，10、20 和50 μmol·L－1松萝酸组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平均降低（P<0.05），Bax 和p-JNK 蛋白表达水平均升高（P<0.05）。与10 μ mol·L－1松萝酸组比较，20 和50 μmol·L－1松萝酸组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平均降低（P<0.05），Bax 和p-JNK 蛋白表达水平均升高（P<0.05）。与20 μ mol·L－1松萝酸组比较，50 μmol·L－1松萝酸组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平降低（P<0.05），Bax 和p-JNK 蛋白表达水平均升高（P<0.05）。各组JNK 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图4 和表3。

表3 各组细胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of p-JNK, JNK, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups（n=3，±s）

表3 各组细胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of p-JNK, JNK, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups（n=3，±s）

*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with 10 μmol·L－1 usnic acid group； #P<0.05 compared with 20 μmol·L－1 usnic acid group.

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图4 各组细胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表达电泳图Fig. 4 Electrophoregram of expressions of p-JNK,JNK, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups

3 讨 论

临床上治疗瘢痕的方法主要包括压迫、冷冻、激光手术等，但由于其各自的局限性和副作用，较难获得理想的治疗效果，因此需要开发新型治疗增生性疤痕药物［10-11］。厚朴酚和山柰酚等中药可通过抑制HSFBs 的增殖活性发挥抗瘢痕增生的作用［12-13］。松萝酸在低等地衣植物中含量较高，是一种具有独特二苯并呋喃骨架的次生代谢产物，具有抑制细胞增殖、迁移和侵袭的作用。研究［14-15］显示：松萝酸可抑制乳腺癌和结肠癌细胞增殖。但目前关于松萝酸在HSFBs 增殖、迁移和侵袭中的研究较少。本研究结果显示：与对照组比较，10、20 和50 μmol·L－1松萝酸组细胞存活率均降低，而细胞凋亡率均升高，且呈剂量依赖性，提示松萝酸可抑制HSFBs 增殖和诱导HSFBs 凋亡。

研究［16］证实：松萝酸具有诱导宫颈癌细胞凋亡的作用。松萝酸可阻滞细胞周期、抑制细胞DNA 合成和产生细胞毒性，抑制细胞的恶性增殖，并诱导细胞凋亡。本研究结果显示：与对照组比较，10、20 和50 μmol·L－1松萝酸组侵袭细胞数和迁移细胞数均减少，且随松萝酸浓度的升高细胞数逐渐递减，提示松萝酸可增强细胞间的黏附性，使细胞不易处于游离状态，抑制HSFBs 迁移和侵袭。

MAPK 信号通路参与多种病理生理过程，是真核细胞调控和介导细胞内信号转导的重要系统，而JNK 是MAPK 信号通路中的重要支路［17］。研究［18］显示：同源盒B9 通过激活MAPK 信号通路促进增生性瘢痕的形成。激活MAPK 信号通路可降低脂多糖刺激的类增生性瘢痕成纤维细胞活性［19］。本研究结果显示：与对照组比较，10、20和50 μmol·L－1松萝酸组细胞中p-JNK 蛋白表达水平升高，且呈剂量依赖性，提示松萝酸可上调JNK 磷酸化，激活JNK/MAPK 信号通路。

细胞凋亡是多种基因共同作用的结果，Bcl-2家族在调控细胞凋亡中具有重要作用，该家族主要包括抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax，当细胞受损或增殖受到抑制时，Bax 和Bcl-2 的表达失衡，Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2 蛋白表达水平降低，从而增加线粒体膜通透性，启动细胞凋亡级联反应［19-23］。本研究结果显示：与对照组比较，10、20和50 μmol·L－1松萝酸组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平均降低，Bax 蛋白表达水平均升高，且呈剂量依赖性，提示松萝酸可调节凋亡相关蛋白表达并诱导HSFBs 凋亡。与DERICI 等［24］的研究结果一致。

综上所述，松萝酸可抑制HSFBs 增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡，同时可促进JNK 磷酸化，激活MAPK/JNK 信号通路。