ST2、NK细胞和B细胞在T2DM患者中的水平及相关性分析*

陈 莉,司徒秋晨,韦 静,吕宏祥Δ

1.南京医科大学附属江宁医院检验科,江苏南京 211100;2.南京医科大学附属南京医院检验科,江苏南京 211100

生长刺激表达基因2蛋白(ST2)又称为白细胞介素(IL)1受体样1(ILR1-L1),属于ILR1-L1家族[1]。该蛋白含有4种亚型,其中两种较为明显,分别为跨膜受体(ST2L)和可溶性ST2(sST2)[2]。研究已证实sST2的表达与分泌主要来源于全身的内皮细胞[3],同时在心、肺、肾以及T淋巴细胞中均有表达[4];此外,在机体局部炎症损伤时同样能够刺激细胞分泌sST2。已有研究表明,sST2作为炎症介质参与心血管疾病[5]以及内分泌疾病[6]的发生,但是具体调控机制还未明确。自然杀伤(NK)细胞是人体免疫至关重要的细胞毒性淋巴细胞,在抗病毒感染和抗肿瘤中发挥着重要作用[7]。有研究发现,NK细胞功能与血糖水平之间存在相关性[8],但2型糖尿病(T2DM)患者的NK细胞分布和功能状态是否发生改变尚不清楚。B细胞介导的免疫反应参与多种疾病的发展进程,在T2DM患者中B细胞可以通过产生IL-6和TNF-α等促炎性细胞因子来调节炎症反应[9],但B细胞反应的差异是否有助于解释肥胖患者的糖尿病发病机制尚不清楚。sST2、NK细胞、B细胞三者在T2DM中的相关性少见报道。本研究拟探讨sST2、NK细胞、B细胞在T2DM患者中的水平及相关性,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2022年10-12月在南京医科大学附属江宁医院住院治疗的50例T2DM患者作为T2DM组,其中男30例、女20例,平均(53.70±1.795)岁;另选取同期在该院体检的30例健康体检者(血常规、尿常规、肝肾功能、心脏彩超、血糖、糖化血红蛋白等检查均无异常)作为对照组,其中男16例、女14例,平均(59.50±2.610)岁。T2DM组与对照组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经南京医科大学附属江宁医院医学伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 Jet-iStar 3000免疫分析仪(中翰盛泰医疗器械有限公司);贝克曼FC500流式细胞仪和自动酶联免疫分析仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司];sST2检测试剂盒(中翰盛泰医疗器械有限公司)、CYTO-STAT tetra CHROME CD45/CD4/CD8/CD3 T细胞与CD45/CD56/CD19/CD3 NK/B细胞(美国贝克曼库尔特有限公司);人Th1/Th2/Th17亚群检测试剂盒(江西赛基生物技术有限公司)。

1.3方法

1.3.1标本收集 收集所有研究对象外周静脉血2 mL,静置10～20 min,3 000 r/min离心15 min后收集上层血清并置于-80 ℃冰箱保存待测,避免反复冻融。

1.3.2收集资料 收集T2DM组和对照组糖化血红蛋白(HbA1c)、葡萄糖(Glu)以及餐后1 h血糖(Glu-1 h)的数据。

1.3.3运用免疫荧光干式定量法检测血清中sST2水平 取血清标本50 μL加入检测缓冲液管中,充分混匀。随后吸取混匀液100 μL垂直滴加至反应板的加样孔中,待反应10 min后快速检测sST2水平。sST2正常范围为0～35 ng/mL。

1.3.4采用流式细胞术(FCM)检测外周血中淋巴细胞亚群以及NK细胞、B细胞比例 采集外周血标本并取100 μL加入流式管中,分别加入10 μL CD45/CD4/CD8/CD3以及CD45/CD56/CD19/CD3流式抗体,涡旋振荡后常温避光孵育15～20 min;反应时间结束后加入500 μL溶血素OptiLyse-C,涡旋振荡充分混匀,常温避光孵育10 min;加入100 μL生理盐水,再次涡旋振荡,常温避光孵育10 min;将Flow-Count振荡混匀10 s,取100 μL混匀液上机检测。淋巴细胞正常范围为20%～40%,B细胞正常范围为5%～18%,NK细胞正常范围为7%～40%。

1.3.5采用流式荧光法检测血清炎症因子水平 按照实验要求设置好标准品管以及标本管。首先,标准品管中加入25 μL梯度稀释的标准品,标本管中加入25 μL的待测样品;其次,在所有管中加入25 μL的荧光检测试剂,充分混匀后,室温避光孵育2.5 h;随后,在各反应孔中加入1 mL PBS溶液,200×g离心5 min后弃上清液;最后,各反应孔中加入100 μL PBS,上机检测IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

2 结 果

2.1两组HbA1c、Glu、Glu-1 h水平比较 T2DM组患者HbA1c、Glu以及Glu-1 h水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组HbA1c、Glu、Glu-1 h水平比较

2.2两组血清sST2水平比较 T2DM组血清sST2水平为(17.08±1.32)ng/mL,明显高于对照组的(11.50±0.77)ng/mL,差异有统计学意义(t=3.07,P<0.05)。见图1。

注:与对照组相比,*P<0.01。图1 两组血清sST2水平比较

2.3两组血清炎症因子水平比较 T2DM组血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2和图2。

注:与对照组相比,*P<0.05; **P<0.01。图2 两组血清炎症因子水平比较

表2 两组血清炎症因子水平比较

2.4两组外周血淋巴细胞、NK细胞以及B细胞比例比较 T2DM组外周血淋巴细胞、NK细胞(CD45+CD3-CD19-CD56+)以及B细胞(CD45+CD3-CD56-CD19+)所占比例均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3和图3。

表3 两组外周血淋巴细胞、NK细胞以及B细胞比例比较

2.5T2DM患者血清sST2水平与NK细胞、B细胞比例的相关性分析 Pearson相关分析结果显示,T2DM患者血清sST2水平与外周血B细胞比例(r=-0.40,P<0.01)、NK细胞比例(r=-0.29,P<0.05)呈负相关;T2DM患者外周血B细胞比例与NK细胞比例呈正相关(r=0.34,P<0.05)。见图4。

图4 T2DM组患者sST2水平及NK细胞、B细胞比例的相关性分析

3 讨 论

糖尿病是一种代谢性疾病,其特征是血液中葡萄糖浓度高,随着时间的推移会导致各种组织、器官损伤,如心脏、肝脏或肾脏。虽然糖尿病的临床定义较为明确,但该疾病的病因仍然不清楚。长期以来,人们将糖尿病分为两种类型:自身免疫性糖尿病即1型糖尿病(T1DM)和非自身免疫性糖尿病即T2DM。尽管T2DM与肥胖和非酒精性脂肪性肝病等代谢紊乱有明确关联[10],但一直缺乏具体的方法或指标来预测哪些个体将会发展成为T2DM。目前的流行病学数据表明,T2DM患者伴有心血管并发症的总体风险即使在调整了传统危险因素后仍然是非糖尿病患者的2～4倍[11]。近年来研究表明sST2水平的增加与心血管疾病密切相关,它可以参与组织、器官促炎与促纤维化的发展进程[5],这是否提示在T2DM疾病进程中sST2发挥至关重要的作用尚不明确。大多数关于肥胖、T2DM以及慢性炎症的研究都集中于先天性免疫上,例如:单核/巨噬细胞的功能转化通过分泌大量的炎症介质如IL-1β、IL-6等参与T2DM患者的组织损伤[10];T2DM患者外周血中存在大量Tim3+NK细胞的功能障碍,进而导致对感染性疾病的易感性增加[12]。但适应性免疫反应在这种情况下也同样发挥着病理学作用,例如:T2DM患者外周血B细胞通过产生IL-6和TNF-α 等促炎性细胞因子来调节炎症反应,并促进促炎T淋巴细胞的功能[13-14]。

NK细胞是先天性免疫系统中的细胞毒性淋巴细胞,在机体抗肿瘤免疫反应和细胞内病原体感染的早期控制中起关键作用[15]。NK细胞作为先天免疫的一部分,可对广泛的危险信号做出反应,NK细胞的功能变化受到化学信使(包括细胞因子)的影响,激活后的NK细胞可以通过受体介导的相互作用和(或)释放细胞毒性颗粒直接诱导靶细胞死亡[16]。NK细胞还可以通过释放促炎性细胞因子如IFN-γ进一步增强固有免疫反应并启动适应性免疫[17]。与T细胞、B细胞不同,NK细胞通过识别非自身细胞而表现出广泛的肿瘤细胞毒性,在无须事先免疫的情况下自发地破坏靶细胞并且不受任何主要组织相容性复合体(MHC)的限制[17]。已有研究表明T2DM患者NK细胞功能障碍会增强其对肿瘤的易感性[18];也有报道称T2DM患者外周血中的NK细胞与血糖控制密切相关[8]。本研究发现在T2DM患者外周血中NK细胞比例明显下调,但同时伴随有sST2水平增加,这可能提示sST2参与调控NK细胞的功能变化。

B细胞介导的免疫反应是保护性抗体和抗原提呈细胞的来源,也是抵御暴露于表面的外源性病原体的第一道防线。当自我耐受功能受损时,自身反应性B细胞产生自身抗体和促炎性细胞因子,导致自身免疫性疾病的发生。近期许多研究已经评估了B细胞中代谢途径的重要性,证明了它们在控制自身免疫和维持免疫稳态中的作用[19]。已有研究表明,在糖尿病受试者中,B细胞适应性反应受损并且分泌较高水平的IL-6和TNF-α引起过度的炎症反应[9]。本研究发现,在T2DM患者外周血中B细胞比例下调且与NK细胞比例呈正相关。由此说明,B细胞与NK细胞协同参与T2DM进展,但具体影响机制尚不明确。

综上所述,T2DM患者血清sST2水平上调,NK细胞与B细胞比例减低,并且sST2水平与NK细胞、B细胞比例呈负相关,而NK细胞比例与B细胞比例呈正相关。在接下来的研究中将进一步探讨sST2在T2DM疾病进展中是否负向调控NK细胞与B细胞,以及NK细胞与B细胞在T2DM发展进程中的相互调控机制,为T2DM患者的治疗提供新的思路。