弓形虫MIC1 蛋白在杆状病毒系统中的表达及活性分析

摘要 为构建可溶性表达弓形虫MIC1 蛋白质的重组杆状病毒株并分析重组蛋白质的活性，通过PCR 扩增弓形虫mic1 基因的编码序列并连接到pFastBac 1 质粒中，将重组的转移质粒转化DH10Bac 感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒，转染Sf9 细胞后连续培养3 代获得重组杆状病毒株。结果显示，Sf9 细胞在感染后的第3天出现典型的细胞病变；间接免疫荧光和Western blot 试验结果表明MIC1 重组蛋白质在感染的Sf9 细胞中成功可溶性表达；纯化的MIC1 重组蛋白质不仅具有结合唾液酸乳糖的能力，同时能够刺激Balb/c 小鼠产生较高水平的特异性抗体（gt;1∶25 600）。以上结果表明，通过杆状病毒表达系统可获得具有生物学活性的弓形虫MIC1重组蛋白质。

关键词 弓形虫； MIC1 蛋白； 杆状病毒系统； 活性分析

中图分类号 S852.7 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2024）01-0210-09

弓形虫（Toxoplasma gondii）是重要的人兽共患寄生原虫，其中间宿主范围广，猫科动物作为其终末宿主［1］。免疫功能健全者感染弓形虫后通常会呈现隐性感染，而免疫功能低下或缺陷人群感染弓形虫后会表现出严重的临床症状，如多器官损害等，甚至引起死亡［2］。孕妇感染弓形虫病后会通过胎盘传播给胎儿，导致胎儿畸形、流产等［3］。不仅如此，动物弓形虫病同样给畜牧业带来不可忽视的经济损失［4-5］。

弓形虫速殖子入侵宿主细胞的过程需多种虫体蛋白质的参与，其中微线体（microneme，MIC）、棒状体（rhoptry，ROP）和致密颗粒（dense granule，GRA）家族蛋白质发挥重要作用。研究表明，MIC1 蛋白质N 末端具有2 个微线体黏合重复域（microneme adhesiverepeat，MAR），能够结合宿主细胞表面唾液酸受体，介导虫体入侵宿主细胞［6］。除此之外，MIC1 蛋白质还具有1 个半乳糖凝集素样结构域（galectinlikedomain）［7］。由于MIC1 蛋白质结构复杂，大肠杆菌表达的MIC1 重组蛋白质通常以无活性的包涵体形式存在，而蛋白质的变性、复性过程复杂、耗时长，同时也难以保证复性蛋白质的生物活性［8］。

与原核表达系统相比，昆虫杆状病毒表达系统对外源蛋白的表达效率高，能对目的蛋白进行翻译后修饰，有助于目的蛋白质的正确折叠而保持良好的生物学活性。有研究者将弓形虫膜表面抗原SAG1 的编码序列（coding sequence，CDS）整合到杆状病毒载体，转染Sf9 细胞，获得能够表达SAG1 蛋白质的重组杆状病毒株［9-11］。本研究利用Bac to Bac杆状病毒表达系统构建能够可溶性表达弓形虫MIC1 蛋白质的重组杆状病毒，并评价重组蛋白质的生物学活性，旨在为弓形虫蛋白质的可溶性表达策略提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、细胞株和实验动物

pFastBac 1 质粒、pET22b 质粒、DH10Bac 感受态细胞和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda ）细胞Sf9 均由沈阳农业大学动物科学与医学学院预防兽医学教研室保存；E. coli DH5α 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；Balb/c 小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司，小鼠的饲养以及试验的开展均通过沈阳农业大学实验动物福利伦理审查委员会的审查和批准。

1.2 主要试剂和耗材

PrimerSTAR Max DNA Polymerase、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒、小型质粒提取试剂盒和血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；SIM SF ExpressionMedium 购自北京义翘神州科技股份有限公司；胎牛血清、青霉素和链霉素购自以色列BI 公司；LipoInsect™转染试剂、杆状病毒穿梭载体Bacmid 小量抽提试剂盒、5×SDS 上样缓冲液、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、TMB 显色液、卡那霉素、庆大霉素和四环素购自上海碧云天生物技术有限公司；甘氨酸购自北京酷来搏科技有限公司；牛血清白蛋白Ⅴ（BSA）购自北京索莱宝科技有限公司；Alexa Flour@488 goat anti-mouse IgG（H+L）购自上海Invitrogen 公司；ProLongTm Gold AntifadeMountant with DAPI 和PageRMLer ™Prestained Protein Ladde 购自美国Thermo Fisher 公司；DNA 标准Marker 购自北京全式金生物技术有限公司；唾液酸乳糖-聚丙烯酰胺-生物素偶联物（3’ sialyllactosepolyacrylamide biotin conjugate，3’SL 和6’ sialyllactose polyacrylamide biotin conjugate， 6’SL）购自美国GlycoNZ 公司；链霉亲和素传感器（Streptavidin，SA）购自德国赛多利斯公司。

1.3 pET22b-MIC1 质粒的构建

收集细胞培养的弓形虫RH 虫株速殖子，提取虫体总RNA 后反转录为cDNA。以cDNA 为模板，根据mic1 基因的CDS 序列，设计带酶切位点的引物MIC1-NdeⅠ-5 与MIC1-XhoⅠ-3（表1），扩增目的片段，再经NdeⅠ与XhoⅠ双酶切，获得带有酶切位点的目的片段。利用NdeⅠ与XhoⅠ双酶切pET22b载体，并分别纯化、回收酶切后的目的片段和线性化载体，通过T4 DNA 连接酶连接目的片段与线性化载体，并转化E. coli DH5α 感受态细胞，筛选阳性菌落，小提质粒获得连接产物pET22b-MIC1。

1.4 pFastBac 1-MIC1 转移质粒的构建

设计带酶切位点的引物MIC1-Xba Ⅰ -5 与MIC1-Hind Ⅲ-3（表1），以pET22b-MIC1 为模板，扩增目的片段，再经Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切获得带有酶切位点的目的片段，利用Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切pFastBac 1 载体，并分别纯化、回收酶切后的目的片段和线性化载体，通过T4 DNA 连接酶连接目的片段与线性化载体，并转化E. coil DH5α 感受态细胞，筛选阳性菌落，小提质粒获得连接产物pFastBac 1-MIC1 转移质粒。

1.5 重组杆粒reBacmid-MIC1 的构建

将转移质粒pFastBac 1-MIC1 转化至DH10Bac感受态细胞中，涂于含X-gal 的三抗（卡那霉素、庆大霉素和四环素）固体平板上，于37 ℃ 培养箱中培养72 h，通过蓝白斑筛选，挑取含重组杆粒的白色单菌落到三抗LB 液体培养基中培养，并用杆状病毒穿梭载体Bacmid 小量抽提试剂盒提取重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-MIC1。通过特异性通用引物pUC/M13-F/R（表1）对提取的重组杆粒进行PCR 鉴定，蓝色菌落（阴性）提取的杆粒DNA 的扩增产物大小应约为300 bp，白色菌落（阳性）提取的重组杆粒DNA 的扩增产物应约为3 700 bp。

1.6 重组杆粒reBacmid-MIC1 转染Sf9 细胞

根据LipoInsect™转染试剂说明书，将2 μL 重组杆粒reBacmid-MIC1 和5 μL 脂质体加到100 μL 无血清SIM SF Expression Medium 培养基中，轻轻混匀，室温静置5 min。将混合液转染处于对数生长期的Sf9 细胞，并设置未转染空白对照组。27 ℃培养箱培养72 h 后，收集上清培养液，此为第1 代重组杆状病毒株。进一步，经3 次细胞传代获得高滴度重组杆状病毒株。通过基因组DNA 提取试剂盒提取第3 次接毒细胞的培养液中杆状病毒基因组DNA，并用pUC/M13-F/R 特异性引物进行PCR 验证，扩增产物约为3 700 bp。

1.7 MIC1 重组蛋白质的表达验证

1）Western blot 验证。在12 孔细胞培养板中每孔接种1×106个Sf9 细胞，接种重组杆状病毒株后在27 ℃恒温培养箱中培养72 h，弃去上层培养液后用PBS 缓冲液洗3 次，经超声裂解细胞后，在4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min 后分别取100 μL 上清和100 μL 重悬后的沉淀，加入30 μL SDS 缓冲液，煮沸10 min，制成蛋白样品进行Western blot 验证。用含1% BSA 的PBST 缓冲液作为封闭液，用Anti-Hismouse 抗体为一抗，HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）为二抗对目的蛋白进行鉴定，目的蛋白大小应在65 ku 左右。

2）间接免疫荧光（indirect immunoinfluscent assay，IFA）验证。在12 孔细胞培养板中铺入细胞爬片，每孔接种1×106 个Sf9 细胞，接种重组杆状病毒株后在27 ℃恒温培养箱中培养72 h，弃去上层培养液后用PBS 缓冲液洗3 次，细胞短暂晾干后，用4%多聚甲醛室温固定15 min，再用冷PBS 缓冲液洗涤3次，然后用封闭液（含1% BSA 的PBST）37 ℃封闭1 h，用Anti-His mouse 抗体为一抗（稀释液为含1%BSA 的PBST），37 ℃孵育1 h 后，PBS 缓冲液洗涤3次，Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG（H+L）作为二抗（稀释液为含1% BSA 的PBST），37 ℃孵育1 h，PBS 缓冲液洗涤3 次，晾干后，滴加含有DAPI 和抗荧光淬灭剂的ProLong ™ Gold Antifade Mountantwith DAPI，用指甲油封片后，在正置荧光显微镜下观察。

1.8 MIC1 重组蛋白质的纯化

吸取500 μL 第3 代重组杆状病毒以1 MOI 接种到Sf9 细胞，在27 ℃培养72 h，观察到明显病变后，将细胞用预冷的PBS 缓冲液重悬，在4 ℃条件下1 500r/min 离心后，用Binding buffer 重悬细胞，超声破碎后，通过亲和层析法纯化重组蛋白质。使用BCA 试剂盒测定重组蛋白质浓度。

1.9 MIC1 重组蛋白质与唾液酸乳糖（3’SL 和6’SL）亲和力检测

本研究使用生物膜干涉技术（biolayer interferometry，BIL）检测MIC1 重组蛋白质与唾液酸乳糖（3’SL 和6’SL）的亲和力。打开Octet® K2 大分子互作仪（德国赛多利斯公司）中的“Data Acquisition”软件，设置相应程序，输入蛋白质相应浓度。SA 传感器预湿后，将其浸入PBS 缓冲液中平衡90 s 后浸入2.4 μmol/L 的3’SL 或6’SL 中（稀释液为PBS 缓冲液），固化600 s 后，再浸入PBS 缓冲液中；将固化完成的SA 传感器浸入含有0.1%BSA 和0.5% Tween-20 的PBS 缓冲液中封闭90 s；MIC1 重组蛋白质分别稀释至0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L（蛋白质稀释液为PBST-BSA），将SA 传感器按稀释浓度顺序浸入蛋白样品中，结合90 s；再将SA 生物传感器浸入含有PBST-BSA 溶液中，解离60 s；最后将SA 传感器浸入盐酸（pH=0.5）溶液中再生900 s。根据不同稀释浓度，重复步骤；检测过程中实时读取结合信号，根据结合信号分析检测结果。样品盘加样设置如图1所示。

1.10 ELISA检测免疫小鼠抗体效价

将6 只Balb/c 小鼠随机平均分成2 组，分别为免疫组（MIC1 重组蛋白质）和阴性对照组（PBS 组）。每组小鼠共免疫4 次，每次间隔14 d，每只小鼠皮下注射100 μg 重组蛋白质或100 μL PBS 缓冲液。免疫组小鼠首次免疫使用弗式完全佐剂与蛋白质1∶1 混合注射，余下3 次免疫使用弗式不完全佐剂与蛋白质1∶1 混合注射。2 组小鼠在第4 次免疫后10 d，摘眼球采血，离心分离得到血清；56 ℃ 灭活血清30min，分装后保存于-20 ℃冰箱。

将MIC1 重组蛋白质稀释至1 μg/mL，每孔加入100 μL，于4 ℃包被抗原18 h；向每孔内加入150 μLPBST 缓冲液以洗涤酶标板，洗3 次，每次3 min；配制1% BSA 溶液，加至酶标板内，每孔100 μL，37 ℃封闭1.5 h；向每孔内加入150 μL PBST 缓冲液以洗涤酶标板，洗3 次，每次3 min；稀释灭活的血清加至酶标板中，每孔100 μL，于37 ℃孵育1 h，使用PBST洗涤酶标板3 次；加入稀释的HRP 标记的山羊抗小鼠二抗，每孔100 μL，于37 ℃中孵育1 h；二抗孵育结束后，用PBST 洗涤酶标板3 次后加入100 μL TMB显色液，避光条件下显色20 min；向每孔内加入50μL 显色终止液，立即用酶标仪进行OD450 nm测定。

2 结果与分析

2.1 pFastBac 1-MIC1 重组转移质粒的构建

由于pFastBac 1 质粒无标签，为了使MIC1 重组蛋白质获得His 标签，首先通过PCR 扩增出弓形虫RH 虫株mic1 基因的CDS 序列，并通过酶切、连接，将MIC1 目的基因连接到pET22b 质粒中，通过此方法在MIC1 蛋白质C 末端添加His 标签（图2A）。进一步以pET22b-MIC1 质粒为模板，用特异的引物扩增目的片段，再次通过酶切、连接，将其转移到pFast‑Bac 1 质粒中（图2B）。

2.2 重组杆粒reBacmid-MIC1构建与PCR鉴定

将鉴定正确的pFastBac 1-MIC1 质粒转入DH10Bac 感受态中，涂于含X-Gal 的三抗（卡那霉素、庆大霉素和四环素）固体平板上，培养72 h 后，三抗培养皿上出现白色的阳性菌落和蓝色的阴性菌落，挑取2 个白色菌落和1 个蓝色菌落，分别置于含有10 μL 去离子水的PCR 管里混匀，使用 PUC/M13 通用引物鉴定MIC1 重组杆粒。如图3A 所示，DH10Bac 菌株包含1 个杆状病毒穿梭质粒（Bacmid），其上含有个mini-attTn7 位点，当pFastBac 1 质粒转化到DH10Bac 菌中，在辅助质粒的帮助下，mini-Tn7 发生转座，从pFastBac 1 切下，插入到miniattTn7位点中，形成重组杆粒。外源基因的插入同时破坏Bacmid 上lacZα 基因的表达，因此，在含有XAGal 的三抗培养基中，发生重组的菌落呈白色，而未重组的菌落为蓝色（图3B）；理论上，重组杆粒reBacmid-MIC1 的PCR 扩增产物大小约为3 700 bp，而未重组的Bacmid 为300 bp。如图3C 所示，白色菌落和蓝色菌落的PCR 扩增产物大小符合预期。

2.3 重组杆状病毒rBV-MIC1 的拯救与鉴定

将reBacmid-MIC1 转染至Sf9 昆虫细胞中，72 h后细胞出现明显病变（如图4A 和4B）。与正常组Sf9 细胞相比，转染reBacmid-MIC1 的Sf9 细胞形状变大、变圆且界限模糊，出现颗粒状物质，细胞容易漂浮。由于拯救的杆状病毒存在于细胞培养液中，分别取转染细胞培养液和正常细胞培养液，提基因组DNA 后，用 PUC/M13 通用引物扩增目的片段。结果如图4C 所示，转染细胞组能够检测到目的片段，大小为3 700 bp，而正常细胞组未见目的条带。以上结果表明，本研究成功获得融合MIC1 基因CDS序列的重组杆状病毒rBV-MIC1。

2.4 IFA检测MIC1 重组蛋白质的表达

将rBV-MIC1 按 1 MOI 病毒量接种Sf9 昆虫细胞，72 h 后对接毒细胞进行IFA 试验检测。在激光共聚焦显微镜下可观察到，感染rBV-MIC1 的 Sf9 细胞出现绿色荧光，阴性未转染组无荧光（ 图 5） ，结果表明MIC1 重组蛋白质在感染的Sf9 细胞中成功表达。

2.5 MIC1 重组蛋白的表达与纯化

收集感染rBV-MIC1 的Sf9 细胞进行Westernblot 检测。结果显示，MIC1 重组蛋白质在细胞裂解液上清和沉淀中都出现目的条带（约65 ku）。表明MIC1 重组蛋白质在感染的Sf9 细胞中能够可溶性表达（图6A）。

使用镍柱纯化MIC1 重组蛋白质，通过SDSPAGE和Western blot 检测纯化后的重组蛋白质，结果如图6B、6C 所示，纯化得到的蛋白质条带单一且大小正确。

2.6 MIC1 重组蛋白与唾液酸乳糖结合能力分析

为了检测纯化的MIC1 重组蛋白质的生物活性，我们用生物膜干涉技术（biolayer interferometry，BLI）检测重组蛋白质与3’SL 和6’SL 的亲和力（KD）。如图7 所示，MIC1 重组蛋白质与3’SL 和6’SL 都能结合，并且结合- 解离曲线的拟合度较好（R2gt;0.95），KD 值分别为0.55、0.816 μmol/L，说明表达纯化的MIC1 重组蛋白质具有结合唾液酸的能力。

2.7 MIC1 重组蛋白质的免疫原性分析

ELISA 检测血清抗体效价时，通常计算阳性血清与阴性血清的吸光度之比（DP/DN），将DP/DN≥2.1 时所对应的抗体最高稀释倍数作为抗体的效价。如图8A 所示，将免疫组和阴性对照组小鼠血清分别用PBS 缓冲液稀释25 600 倍时，阳性血清与阴性血清的DP/DN仍大于4，说明免疫组小鼠血清中抗体效价较高。Western blot 验证结果显示，免疫组小鼠血清能够特异性地识别弓形虫RH 株速殖子的裂解抗原（lysed toxoplasma antigen，TLA），目的条带单一、大小正确；而阴性组小鼠血清没有检测到目的条带（图8B 和8C）。

3 讨论

弓形虫速殖子主动入侵宿主细胞，此过程中需要分泌多种微线体蛋白，其中MIC1、MIC4 和MIC6形成复合物定位于虫体表面，并通过MIC1 的MAR结构域识别宿主细胞表面唾液酸受体［12］。有研究表明，MIC1 在我国弓形虫优势基因型Chinese 1 不同毒力株中的表达存在差异［13］，且有研究还发现MIC1可与小鼠树突状细胞和巨噬细胞的TLR2 和TLR4受体结合导致细胞因子风暴和宿主死亡，发挥重要的免疫调节功能［14］。有研究者通过乳糖凝胶柱亲和层析的方法纯化弓形虫速殖子裂解液，以获得大量的MIC1 和MIC4 蛋白质免疫小鼠，免疫后的小鼠获得了抵抗弓形虫弱毒株的感染［15］。已有研究表明，原核系统表达的MIC1 重组蛋白质通常以无生物活性的包涵体形式存在，而包涵体的变性、复性耗时长、效率低，不利于蛋白质功能研究的展开［16-18］。通过稀有密码子在线分析软件（http：//www.detaibio.com/tools/rare-codon-analyzer. html）分析结果表明MIC1 基因在大肠杆菌中使用频率低于20% 的密码子占总密码子的19%，而在Sf9 细胞中所有密码子的使用频率均高于20%，因此从理论上推测，昆虫杆状病毒表达系统更有利于MIC1 重组蛋白质的表达。本研究中我们选择了pFastBac1 载体构建表达MIC1蛋白质的重组杆状病毒，但是该载体本身不带标签，为了方便纯化，我们首先将MIC1 基因CDS 序列插入pET22b 载体中，在其C 端添加His 标签，再通过分子克隆将新构建的表达框插入pFastBac1 载体中，获得的重组杆状病毒能够在Sf9 细胞中可溶性表达目的蛋白质。

为了鉴定MCI1 重组蛋白质是否具有唾液酸受体结合，本研究采用生物膜干涉（BLI）技术检测重组蛋白质与唾液酸乳糖的结合能力。BLI 技术可以实现生物分子之间相互作用的实时分析检测，对生物分子亲和力进行实时、无标记的分析［19］。有研究者利用BLI 技术检测流感病毒血凝素蛋白质与唾液酸乳糖的亲和力［20］。本研究结果表明MIC1 重组蛋白质与2 种唾液酸乳糖（3’SL 和6’SL）都具有结合能力，亲和力（KD）均在微摩尔级，且与前者的结合力略高于后者；同时，将纯化的MIC1 重组蛋白质免疫Balb/c 小鼠后，产生较高水平的特异性抗体，抗体滴度高于1∶25 600。以上结果表明，重组蛋白质具有良好的生物学活性。

获得大量的高活性的重组蛋白质对于寄生虫学的研究是至关重要的［21］。孔祥礼等［22］通过杆状病毒表达系统成功表达恶性疟原虫Kelch 13 株F446I（pfK13-F446I）重组蛋白质，获得的重组蛋白质具有很好的可溶性及生物学活性；徐瑞敏等［23］使用杆状病毒表达系统成功表达日本血吸虫热休克70 蛋白（SjHSP70），为深入研究SjHSP70 分子的免疫生物学功能提供了材料。Lee 等［24］通过杆状病毒表达系统表达弓形虫ROP18 和MIC8 重组蛋白质，免疫小鼠后，ROP18+MIC8 疫苗在小鼠体内诱导了强烈的体液免疫反应，可以抵抗弓形虫急性和慢性感染。

张耀［25］利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达了捻转血矛线虫H11-1 和H11-2 糖蛋白，得到的重组蛋白质均具有良好的氨基肽酶活性，且可以与保护性抗体发生免疫反应。尽管杆状病毒表达系统可以对表达的外源蛋白质进行翻译后修饰、加工，表达出接近于天然构象的重组蛋白质，但是由于杆状病毒表达系统在翻译后修饰和蛋白质组装方面与哺乳动物细胞仍有差别，进一步完善杆状病毒表达系统在寄生虫蛋白表达领域中的作用值得深入研究。

参考文献References

［1］ DUBEY J P，JONES J L.Toxoplasma gondii infection in humans

and animals in the United States［J］.International journal

for parasitology，2008，38（11）：1257-1278.

［2］ 刘荣荣，张晓磊，张进顺，等. 刚地弓形虫ROP10-ROP18 真

核表达载体的构建与鉴定［J］. 中国病原生物学杂志，2018，

13（6）：612-616.LIU R R，ZHANG X L，ZHANG J S，et al.

Construction and identification of eukaryotic expression vector

of Toxoplasma gondii ROP10-ROP18［J］. Journal of pathogen

biology，2018，13（6）：612-616 （in Chinese with English

abstract）.

［3］ 苏朝康，邬质彬，郭湘碧，等. 弓形虫感染对孕妇妊娠结局的

影响［J］. 中国优生与遗传杂志，2002，10（1）：78-79.SU C K，

WU Z B，GUO X B，et al.The effects of Toxoplasma infection

on pregnancy in woman［J］.Chinese journal of birth health amp;

heredity，2002，10（1）：78-79 （in Chinese with English abstract）.

［4］ 闫鑫磊，韩汶荧，韩笑，等. 内蒙古中西部绵羊弓形虫病血清

学调查［J］. 中国兽医杂志，2021，57（1）：44-46.YAN X L，

HAN W Y，HAN X，et al.Serological investigation of Toxo⁃

plasmosis in sheep in central and western Inner Mongolia［J］.

Chinese journal of veterinary medicine，2021，57（1）：44-46（ in

Chinese）.

［5］ 杨娜，邢蒙恩，王大为，等. 辽宁省猪源弓形虫虫株分离与鉴

定［J］. 华中农业大学学报，2017，36（2）：84-88.YANG N，

XING M E，WANG D W，et al.Isolation and identification of

Toxoplasma gondii strains from pigs in Liaoning Province［J］.

Journal of Huazhong Agricultural University，2017，36（2）：84-

88（ in Chinese with English abstract）.

［6］ HAGER K M，CARRUTHERS V B.MARveling at parasite

invasion［J］.Trends in parasitology，2008，24（2）：51-54.

［7］ LOURENÇO E V，PEREIRA S R，FAÇA V M，et al.Toxo⁃

plasma gondii micronemal protein MIC1 is a lactose-binding

lectin［J］.Glycobiology，2001，11（7）：541-547.

［8］ 庄浩瀚，潘灵韬，姚晨倩，等. 弓形虫SAG1 重组抗体制备

及抗原表位鉴定［J］. 中国兽医学报，2021，41（6）：1080-

1085.ZHUANG H H，PAN L T，YAO C Q，et al.Preparation

of Toxoplasma gondii SAG1 recombinant antibody and

identification of its epitope［J］. Chinese journal of veterinary

science，2021，41（6）：1080-1085 （in Chinese with English

abstract）.

［9］ CHOI W H，PARK J S.Immunogenicity and protective effect

of a virus-like particle containing the SAG1 antigen of Toxo⁃

plasma gondii as a potential vaccine candidate for toxoplasmosis

［J/OL］. Biomedicines，2020，8（4）：91［2023-04-18］.

https：//doi.org/10.3390/biomedicines8040091.

［10］ 陈晓光，刘国章，江静波. 含弓形虫P30 基因插入昆虫杆状病

毒的研究［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1996，14（4）：

270-273. CHEN X G，LIU G Z，JIANG J B. Construction of

the recombinant baculovirus including p30 gene of Toxoplas⁃

ma gondii［J］.Chinese journal of parasitology and parasitic diseases，

1996，14（4）：270-273 （in Chinese with English abstract）

.

［11］ 严延生，翁育伟，杨婷婷，等. 弓形虫主要抗原基因（SAG1）在

昆虫细胞中表达的研究［J］. 中国人兽共患病杂志，1997，13

（6）：16-19.YAN Y S，WENG Y W，YANG T T，et al.Study

on the expression of Toxoplasma gondii SAG1 gene in incect

cells［J］.Chinese journal of zoonoses，1997，13（6）：16-19 （in

Chinese with English abstract）.

［12］ GARNETT J A，LIU Y，LEON E，et al. Detailed insights

from microarray and crystallographic studies into carbohydrate

recognition by microneme protein 1 （MIC1） of Toxoplasma

gondii［J］.Protein science：a publication of the protein society，

2009，18（9）：1935-1947.

［13］ WANG Y，HAN C J，ZHOU R S，et al． Differential expression

of TgMIC1 in isolates of Chinese 1 Toxoplasma with different

virulence［J/OL］．Parasites amp; vectors，2021，14（1）：253

［2023-04-18］. https：//doi.org/10.1186/s13071-021-04752-z.

［14］ SARDINHA-SILVA A，MENDONÇA-NATIVIDADE F

C，PINZAN C F，et al． The lectin-specific activity of Toxo⁃

plasma gondii microneme proteins 1 and 4 binds Toll-like receptor

2 and 4 N-glycans to regulate innate immune priming［J/

OL］. PLoS pathogens，2019，15（6）：e1007871［2023-04-18］.

https：//doi.org/10.1371/journal.ppat.1007871.

［15］ LOURENÇO E V，BERNARDES E S，SILVA N M，et al.

Immunization with MIC1 and MIC4 induces protective immunity

against Toxoplasma gondii［J］. Microbes and infection，

2006，8（5）：1244-1251.

［16］ ALLMAN S A，JENSEN H H，VIJAYAKRISHNAN B，et

al. Potent fluoro-oligosaccharide probes of adhesion in Toxo⁃

plasmosis［J］.ChemBioChem，2009，10（15）：2522-2529.

［17］ FRIEDRICH N，SANTOS J M，LIU Y，et al.Members of a

novel protein family containing microneme adhesive repeat domains

act as sialic acid-binding lectins during host cell invasion

by api complexan parasites［J］.Journal of biological chemistry，

2010，285（3）：2064-2076.

［18］ SAOUROS S，SAWMYNADEN K，MARCHANT J，et al.

Complete resonance assignment of the galectin-like domain of

MIC1 from Toxoplasma gondii in complex with the second

EGF domain from MIC6 and the backbone assignment in complex

with the third EGF domain［J］. Biomolecular NMR assignments，

2008，2（2）：175-177.

［19］ 张艳，姜丽艳，张晓光，等. 生物膜干涉技术在生物分子间相

互作用检测中的应用［J］. 生命科学仪器，2019，17（2）：49-52.

ZHANG Y，JIANG L Y，ZHANG X G，et al.Application of

biolayer interferometry in detection of biomolecular interaction

［J］.Life science instruments，2019，17（2）：49-52 （in Chinese

with English abstract）.

［20］ CARVALHO S B，MOLEIRINHO M G，WHEATLEY D，

et al.Universal label-free in-process quantification of influenza

virus-like particles［J/OL］. Biotechnology journal，2017，12

（8）： 28514082［2023-04-18］. https：//doi. org/10.1002/biot.

201700031.

［21］ 景志忠，王佩雅，才学鹏. 杆状病毒表达系统研究进展及在寄

生虫基因工程疫苗中的应用前景［J］. 中国兽医科技，2001，

31（3）：43-45. JING Z Z，WANG P Y，CAI X P. Research

progress of baculovirus expression system and its application

prospect in parasite genetic engineering vaccine［J］. Chinese

veterinary science，2001，31（3）：43-45（ in Chinese） .

［22］ 孔祥礼，燕贺，涂宏，等. 恶性疟原虫pfK13-F446I 基因重组杆

状病毒质粒的构建及其在昆虫细胞SF9 中的表达［J］. 中国

病原生物学杂志，2021，16（4）：442-445.KONG X L，YAN

H，TU H，et al.Construction and expression of a recombinant

baculovirus plasmid with the K13-F446I gene of Plasmodium

falciparum in Spodoptera frugiperda 9 cells［J］. Journal of

pathogen biology，2021，16（4）：442-445（ in Chinese with English

abstract）.

［23］ 徐瑞敏，李运燕，段明明，等. 日本血吸虫热休克蛋白70 在昆

虫细胞Sf9 中的表达鉴定［J］. 中国动物传染病学报，2013，21

（3）：45-50.XU R M，LI Y Y，DUAN M M，et al. Expression

and identification of heat shock protein 70 of Schistosoma ja⁃

ponicum in insect cell Sf9［J］ Chinese journal of animal infectious

diseases， 2013，21（3）：45-50 （in Chinese with English

abstract）.

［24］ LEE S H，KANG H J，LEE D H，et al.Virus-like particle vaccines

expressing Toxoplasma gondii rhoptry protein 18 and

microneme protein 8 provide enhanced protection［J］.Vaccine，

2018，36（38）：5692-5700.

［25］ 张耀．捻转血矛线虫H11 糖蛋白疫苗候选分子的筛选及其免

疫保护作用研究［D］．武汉：华中农业大学，2023．ZHANG

Y． Screening of protective antigens of Haemonchus contortus

H11 glycoprotein and verification of its immune protection［D］．

Wuhan：Huazhong Agricultural University，2023 （in Chinese

with English abstract）．

（责任编辑：边书京）