2%辣椒素纳米型水乳剂的研制及其抗虫效果分析

摘要：旨在开发一款绿色防控中药材种植中易发的红叶螨的生物农药，以辣椒提取物为原料，通过对6 种乳化剂、消泡剂、防冻剂等种类的筛选和用量试验以及考察转相剪切转速，确定辣椒提取物纳米型水乳剂生物农药配方及制备工艺；同时以1.8% 阿维菌素为阳性对照评估其抗虫效果。结果表明，单一乳化剂均不能形成稳定水乳剂，EL-40 和S-20 的乳化效果优于其他乳剂，且二者复配比例为9∶1 时，乳化效果最佳，无析水、有少量析油；剪切转速考察发现，转速大于8 000 r/min 时，不再析油；Zeta 电位及纳米粒径分析仪显示，当剪切转速为9 000 r/min时，水乳剂粒径跨度值最小，为1.48；0.1% 的消泡剂和2% 的乙二醇可达到理想的消泡和防冻效果。杀虫效果显示，当该产品稀释100 倍（6.3 μg/mL）时，第4 天累计趋避杀灭率达94.9%，显著高于其他稀释组和阳性对照，500 倍液与阳性对照效果相当。综上，当生物农药的制备工艺为2% 辣椒素稀释液、8% 冬青油、2% 乙二醇、0.1% 消泡剂、10% 复配乳化剂（EL-40∶S-20=9∶1）、80% 蒸馏水，剪切转速为9 000 r/min 时，该产品具有良好的杀灭红叶螨效果。

关键词：辣椒；辣椒素；纳米型；水乳剂；抗虫效果

中图分类号：S482.1 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2024）04‒0142‒08

辣椒Capsicum annuum（Linn）为茄科辣椒属1 年或有限多年生草本植物。辣椒果实是人们常用的食材之一，因其含有辣椒素而有辣味，能增进食欲。现代药理研究表明，辣椒素具有镇痛、抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌[1-4]等功效。FRAGOSO 等[5]研究表明，辣椒水提物对小番茄蛀虫（Neoleucinodes el⁃egantalis）具有一定的杀灭活性。ISMAIL 等[6] 报道，辣椒提取物中小分子化合物可通过激活宿主植物抗螨防御系统来抑制棉叶螨（Tetranychus urti⁃cae）对植物的伤害，抑制率达93.36%，其活性与阿维菌素相当。这些小分子化合物是辣椒素类物质（主要为辣椒碱和二氢辣椒碱）[1，3]。有研究表明，辣椒素通过神经毒性致害虫麻痹、瘫痪，并兼有胃毒性，使害虫的生理代谢受阻而死亡[7]。其神经毒性作用在体外的非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞、小鼠以及大鼠体内模型中得到证实。ALZAABI 等[8]研究表明，辣椒素通过抑制爪蟾卵母细胞和大鼠海马神经元中的α7-烟碱乙酰胆碱受体的表达，进而影响神经信号的传递。BALLEZA-TAPIA 等[9]使用小鼠模型证明了辣椒素通过TrpV1 受体非依赖性通路损伤Na+/K+-atp 酶，抑制小鼠正常海马神经元的活动。大量研究还表明，辣椒素类物质不仅对小地老虎、蚜虫、东方黏虫、温室白粉虱以及菜青虫有防治作用[10-13]，还可用于驱鼠[14-15]。目前，辣椒提取物研制的农药剂型有乳油、微胶囊悬浮剂和粉剂，但未见其纳米型水乳剂的相关报道[7]。

红叶螨（Tetranychus cinnbarinus）除了会危害农作物外[16]，也会对中药材如怀地黄造成危害[17]。杜鹃兰每年8—12 月均有红叶螨虫害，9—10 月为虫害爆发期，12 月后红叶螨活跃度下降直至消失。当前防治螨虫的主要手段是使用化学杀螨剂，但化学农药的过度使用会对环境、药材等造成不利影响[18]。随着我国对环境保护的高度重视，在农业领域加强对高毒、易残留农药的管理，低毒、低残留或无残留农药是我国新型农药发展的一个重要方向[19]。辣椒素具有易溶于有机溶剂、难容于水的性质[7]，可利用相应的乳化剂将其制备成O/W 型水乳剂，以增大其在水中的溶解度。水乳剂以水为分散介质，可减少有机溶剂的使用，能显著降低农药在作物和环境中的残留，已被国际公认为环境安全的农药新剂型之一，可替代传统乳油农药[20]。纳米颗粒粒径为纳米级，易被害虫皮肤和宿主植物吸收，能提高农药的生物利用度，提高杀虫效果。为此，本研究针对螨虫虫害从辣椒中提取出辣椒素类有效杀虫成分，并采用现代制剂手段研制纳米型水乳剂生物农药，以期为杜鹃兰等中药材螨虫虫害的绿色防控提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

干辣椒样品购自生活超市，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为茄科辣椒属植物辣椒Capsicumannuum（Linn）的果实。杜鹃兰种植于贵州中医药大学中药材种植圃。

1.2 试剂与仪器设备

冬青油（水杨酸甲酯）购自邦源生物；三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（农乳601）、蓖麻油环氧乙烷加成物（By140）、聚氧乙烯月桂酸酯（2301）、荨麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、十二烷基苯磺酸钙（500）、失水山梨醇月桂酸酯（S-20）均购自江苏省海安石油化工厂；1.8% 阿维菌素乳油购自河北中保绿农作物科技有限公司；有机硅消泡剂购自东莞市德丰消泡剂有限公司；分析纯乙二醇和95% 乙醇购自天津市富宁精细化工有限公司；分析纯无水氯化钙和无水氯化镁购自无锡市亚太联合化工有限公司。

高剪切乳化机（FJ500-SH，安徽炎信生物科技有限公司）；旋转蒸发器（RE-52A，上海亚荣生化仪器厂）；Zeta 电位及纳米粒径分析仪（DelsaNanoc，美国贝克曼库尔特公司）；电子分析天平（SQP，瑞士Mettler-Toledo 公司）；电热恒温鼓风干燥箱（101-1AB，天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 辣椒素稀释液的制备

将除去蒂和籽的干辣椒于50 ℃下烘干后粉碎，过0.425 mm 筛，收集备用。称取辣椒粉25.00 g，加入100 mL 95% 乙醇，超声提取35 min（功率90 W）。重复提取2 次，合并2 次滤液，减压浓缩，滤液挥发至10 mL 左右时取出滤液，将浓缩液置于120 ℃ 恒温箱中烘干至恒质量。向辣椒提取浓缩物中加入少量冬青油，超声使其溶解，多次重复操作，使充分溶解，转移至50 mL容量瓶，用冬青油定容至刻度，摇匀，作为辣椒素稀释液备用。

1.3.2 乳化剂筛选

选择农乳601、By140、EL-40、500、S-20 和2301 等6 种乳化剂进行种类筛选试验。参照张贵森等[21]的方法制备水乳剂，分别精密量取6 种乳化剂各10 mL 至烧杯中，再依次加入2 mL 辣椒素稀释液和8 mL 冬青油，搅拌均匀作为油相，再缓慢加入80 mL 蒸馏水，采用转相法（剪切速度为5 000 r/min）持续剪切5 min，即制得该产品水乳剂，每种乳化剂重复做3 批。分别参照GB/T 19137—2003《农药低温稳定性测定方法》和GB/T 19136—2003《农药热贮稳定性测定方法》，计算水乳剂在低温（0±2）℃和高温（54±2）℃贮存下的析水、析油率，以及常温（25±2）℃ 放置30 d 的析水、析油率，后续贮存试验设计同此。

1.3.3 乳化剂复配

基于1.3.2 的试验结果，单一乳化剂或多或少均有水析出，因此，选择析水量较少的2 款乳化剂S-20 和EL-40 进行复配试验，复配（EL-40∶S-20）体积比例设置为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 和1∶9，共9 组，重复3 次。计算水乳剂在常温、低温和高温贮存下的析水和析油率。

1.3.4 剪切转速确定

转相法制备水乳剂，考察剪切转速对乳化效果的影响，剪切转速分别设置为5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 r/min，以各贮存条件下产品析水、析油情况及其粒径分布为评价指标。

1.3.5 粒径测定

采用Zeta 电位及纳米粒径分析仪测定1.3.4 中各个剪切转速下所制备水乳剂的粒径，设定D10，D50 和D90 等3 个特征指标，分别表示乳剂粒径在累积分布曲线中所占百分比为10%、50% 和90% 时所对应制剂的平均粒径，计算δ 值（（D90‐D10）/D50）。

1.3.6 消泡剂用量

向水相中分别添加0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3% 的有机硅消泡剂，制备该水乳剂，在第0、1、2、3、4、5 min 吸取泡沫，测量体积，考察消泡效果。

1.3.7 乙二醇用量

向水相中分别添加0%、1%、2%、3%、4% 和5% 的乙二醇，制备水乳剂，并放于-18 ℃冰箱冷冻过夜，次日取出放常温下自然溶解，观察水乳剂析水、析油情况，测量其体积，计算析水、析油率。

1.3.8 水乳剂性能指标测试

以上述试验确定的配方和工艺制备辣椒素纳米型水乳剂，开展该产品性能指标测试。根据GB/T 1603—2001《农药乳液稳定性测定方法》，考察该产品在标准硬水中的稳定性和分散性。按照GB/T 19136—2021《农药热贮稳定性测定方法》和GB/T 19137—2003《农药低温稳定性测定方法》对产品的热贮、冷贮稳定性进行测定，并计算其析出率。

1.3.9 水乳剂杀虫浓度考察

按照筛选出的配方和工艺配制100 mL 水乳剂（辣椒素稀释液占比为2%），取适量水乳剂，分别稀释至100、250、500、1 000 倍液备用。按照1.8% 阿维菌素乳油的说明书将其稀释成750 倍液，作为阳性对照组。通过5 点取样法随机选取10 株受害的杜鹃兰植株（每个点取2 株），每组试验区间隔2 m，统计每组的虫口数量，作为本组的本底虫口数。于2022年9月22日，分别将辣椒素水乳剂100（6.3 μg/mL）、250（2.52 μg/mL）、500（1.26 μg/mL）、1 000（0.63 μg/mL）倍稀释液和阿维菌素乳油750 倍稀释液均匀喷洒于受害植株叶片的背面和正面，每隔1 d 统计每组杜鹃兰叶上红叶螨存活的虫口数量，连续统计8 d，计算各组的趋避杀虫率。

1.4 数据分析

所有数据经Excel 2016 整理后，采用SPSS26.0 和GraphPad Prism 9.0 软件对试验所得数据进行分析及作图。

析水率=析水体积/水相总体积×100% （1）

析油率=析油体积/油相总体积×100% （2）

趋避灭杀率=（本底虫口数-存活虫口数）/本底虫口数×100% （3）

2 结果与分析

2.1 辣椒素稀释液的制备及乳化剂种类筛选

3 次辣椒素提取液浓缩恒质量后平均质量为1.576 7 g，RSD 值为6.01%，小于10%，说明提取方法重现性好，可行。冬青油复溶至50 mL 的辣椒素稀释液质量浓度为31.5 mg/mL。

从表1 可以看出，601 组出现油水分层现象，说明该乳化剂10% 的用量未能乳化辣椒素稀释液，其他组在10% 的用量下，存在一定程度的析水、析油问题。如By140、500 和2301 等3 种乳化剂在热贮和冷贮均有析水、析油的情况，平均最低析油率为2.23%，最高达8.83%；比较发现，EL-40 和S-20 的乳化效果较好，在冷贮条件下均无析水、析油情况，常温条件下EL-40 无析水、析油现象，S-20有少量析水、析油，最高析油率为1.50%，热贮条件下均存在析水、析油现象，最高析油率为2.17%。这表明在不增加乳剂用量的情况下，单用一种乳化剂均不能制备合格的水乳剂，可考虑将EL-40与S-20 进行复配，改善乳化效果。

2.2 乳化剂复配比例筛选

从表1 和2 可以看出，EL-40 与S-20 复配与单用相比，对冷贮无影响，复配比例大于6∶4 时，能改善单用S-20 的析水问题，随着EL-40 所占比例增加，析水量在冷贮、常温、热贮时逐渐减少，故选择乳化剂比例为EL-40∶S-20＝9∶1。

2.3 剪切转速对乳化效果的影响

为解决复配热贮析油的问题，通过增加剪切转速，获得适宜乳液颗粒粒径，提高乳剂的稳定性。由表3 可知，随着剪切转速的增加，热贮析油量逐渐减少。当转速达到8 000 r/min 时，水乳剂在冷贮、常温贮存和热贮时均无油析出。由表4 可知，相较于8 000 r/min，转速为9 000 r/min 时水乳剂的D50 和D90 粒径小，δ 值小，粒径跨度小（图1），水乳液稳定性增强。结合析油率、粒径和δ 值结果，水乳剂的剪切转速确定为9 000 r/min。

2.4 消泡剂用量考察

从图2 可以看出，在0.1%、0.2%、0.3% 的消泡剂添加量的情况下消泡速率相差不大，在0、0.05%的消泡剂添加量下消泡速率较低，故选择0.1% 的消泡剂添加量。

2.5 乙二醇防冻效果考察

本研究结果表明，水乳剂在-18 ℃条件下冷冻并恢复到室温后，不添加乙二醇和添加量为1%时，冻融析油量分别为4.00% 和1.11%；添加2%、3%、4%、5% 乙二醇后均无水、无油相析出，故选择添加2% 的乙二醇。

2.6 水乳剂性能指标测定结果

乳液滴入硬水中呈云雾状，有颗粒下沉，但能基本分散，其在200 倍硬水中静置1 h 后未明显出现浮油、沉淀和分层的现象，热贮和冷贮离心后均有极少量的析出物，析出率分别为0.62% 和0.24%，轻轻摇晃后能混合均匀（图3）。综上说明，该水乳剂在硬水中的稳定性、分散性以及存贮稳定性均表现良好。

2.7 产品杀虫效果评价

辣椒素乳剂对红叶螨的杀灭效果如图4 所示。

由图4 可知，施药后前4 天红叶螨虫口数量持续减少，在第4 天趋避灭杀率达到了第1 次高峰，辣椒素水乳剂稀释100（6.3 μg/mL）、250（2.52 μg/mL）、500（1.26 μg/mL）、1 000（0.63 μg/mL）倍和阿维菌素乳油稀释750 倍后的驱避灭杀率分别为94.9%、78.4%、78.45、75.8%、80.4%，该产品稀释100 倍时的趋避灭杀率高于阿维菌素。第5 天，各浓度下趋避灭杀率均下降约20%，说明有虫卵大量孵化，也间接说明该产品对红叶螨虫卵无灭杀效果。此后，趋避灭杀率又快速升高，说明药效还在持续发挥作用。第7 天，该产品的100、250、500 倍稀释液和阿维菌素的趋避灭杀率达到了第2 次高峰，趋避灭杀率分别为95.0%、94.6%、92.8%、93.2%。第8 天趋避灭杀率趋于达到平衡状态，且均达到90% 以上。由于红叶螨虫卵时有孵化，趋避杀灭率未达100%，需要在第10 天左右第2 次给药。

3 结论与讨论

单一乳化剂在转相过程中所形成的界面膜往往不够稳定。本试验得出，使用单一乳化剂或多或少存在析水、析油的问题，可利用不同乳化剂的理化特性产生乳化协同效应，提高界面膜的机械强度，抵抗液滴聚集变大，以提高乳剂的各项性能和制剂的稳定性[22]。本研究表明，当使用乳化剂EL-40 与S-20 复配时，可很大程度上改善析水、析油问题，复配比例为（9∶1）时仅可见少量析油现象。

随着乳化机剪切转速的增大，其乳剂稳定性先增大后逐渐趋于平稳[23]。乳液平均粒径及其粒径跨度（δ）是表征乳液稳定性的重要物理指标[24-25]，其平均粒径越小，沉降速率越慢，分布越集中，乳液越稳定；δ 值越小，表明粒径分布越窄，分散性能越好，所制备的乳剂稳定性越好，则体系越稳定。本试验结果表明，转速在8 000 r/min 后稳定性趋于平稳，水乳剂热贮不再析油，且9 000 r/min 的δ 值更小，在该剪切转速下的水乳剂更稳定，这与张永康等[26]的研究结果一致。

乳剂附加防冻剂可使水乳剂在低温时保持良好的流动性和稳定性[24]，有机硅类消泡剂能降低液体表面张力，增加气泡合并、破裂和释放到空气中的速度[27]。本试验结果表明，0.1% 消泡剂和2% 乙二醇能达到最佳效果，这与王秦等[28]、苑璐等[29]的研究结果一致。

有研究报道，当辣椒素质量浓度大于8.0 mg/mL时，对害虫赤拟谷盗和谷蠹均表现出较好的驱避杀灭效果，而在糙米中质量浓度为1.0 mg/g 时，对上述2 种害虫则表现出明显的拒食作用[30]。据报道，LC30 亚致死浓度（1 400 mg/L）的辣椒素提取物能显著抑制朱砂叶螨卵的孵化，且少数孵化出的幼螨也不能正常发育到成螨[31]。本试验通过该产品4 个稀释度试样和阿维菌素阳性对照试样对红叶螨驱避灭杀效果的比较，发现第4 天时，100 倍的水乳剂稀释液杀虫效果优于阿维菌素阳性组，第8 天该试验组与阿维菌素阳性组杀虫效果相当。另外，研究表明该产品对红叶螨虫卵无明显杀灭活性，后续拟采取纯化辣椒提取物及优化配方等策略，改善该产品对虫卵膜的穿透能力，以达到杀灭虫卵的作用。

本研究通过对辣椒素水乳剂制备工艺的研究，获得了较适宜的配方及制备工艺，即2% 辣椒素稀释液（31.5 mg/mL）、8% 冬青油、2% 乙二醇、0.1%消泡剂、10% 复配乳化剂（EL-40∶S-20=9∶1）、80% 蒸馏水，剪切转速为9 000 r/min。相较阿维菌素抗虫效果，该产品展现出较好的杀灭红叶螨虫体的作用，具有极高的开发潜力。

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基金项目：国家自然科学基金项目（82260741） ；贵州省科技计划项目（黔科合支撑［2021］一般251，黔科合基础-ZK［2022］一般478）；2021年国家自然科学基金后补助资金科研创新探索专项（2018YFC170610519）