葛根-鱼腥草解酒复方配伍比例的响应面优化

方元平,徐俊伟,刘 胜,刘辰哲,向 福

(1．经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,湖北 黄冈 438000;2．黄冈师范学院 李时珍大健康研究院,湖北 黄冈 438000;3．湖北省中科产业技术研究院,湖北 黄冈 438000)

鄂东大别山地区被誉为中原地区的物种资源库和生物基因库,也是湖北境内幸存的唯一一块较完整的华东植物区系代表地,诞生了“医药双圣”李时珍、“北宋医王”庞安时等五大名医[1]。该地区适宜的生长环境,复杂的地理环境,独特的地理优势为药用植物的生长发育提供了有利条件,盛产葛根、鱼腥草、茯苓等药材[2]。大别山地区的葛根资源丰富,据调查数据显示,葛根的年产量在 2 万吨以上,与葛根相关的产业链已逐步成为促进大别山革命老区经济发展的重要手段[3]。

酒文化源远流长,酒几乎渗透到人们生活的各个领域。随着全民经济的飞速发展,饮酒已经成为危害全国人民身体健康的第三大行为危险因素[4-6]。相较于现代的化学药物治疗方法,中药材作为天然药物,具有副作用小、效果显著、成本较低等优势,在饮酒所引起的疾病或伤害中可以发挥不可替代的治疗作用[7]。随着市场上各种天然类制品的研发,利用药食同源的中药材研制解酒类功能保健品将成为未来发展的新趋势[8-10]。

近年来的研究结果显示,具有解酒保肝作用的方剂能显著降低血清中转氨酶活性[11-13]。现代研究表明,鱼腥草[14]、葛根[15-17]、枳椇子[18-20]和茯苓[21-22]的提取物均能显著抑制大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的活性,减少急性酒精中毒的醒酒时间。同时查阅中医典籍,选取鱼腥草、葛根、枳椇子和茯苓四种药食同源的药用植物制备汤剂[23],研发解酒类功能保健品。本研究以葛根、鱼腥草、茯苓、枳椇子四种药用植物为材料,在单因素试验的基础上,利用响应面设计方法对葛根-鱼腥草解酒复方的配伍比例进行优化,旨在研发能显著抑制谷丙转氨酶活性的葛根-鱼腥草解酒复方,为葛根等大别山特色药用植物资源的科学开发和合理利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

鱼腥草、葛根、枳椇子、茯苓、新鲜猪肝:黄冈市市售;谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒:南京建成生物工程研究所;葛根枳椇子压片糖果:北京同仁堂兴安保健科技有限责任公司。

1.2 仪器与设备

中药粉碎机:浙江省瑞安市飞达药材器械厂;全自动煎药壶:康雅顺电器有限公司;UV1901CS型双光束紫外可见分光光度计:上海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1葛根-鱼腥草解酒复方药液的制备工艺

准确称定充分干燥至恒定质量的葛根、鱼腥草、茯苓和枳椇子,相继放入全自动煎药壶中。加入适量蒸馏水,使之浸没药材,水平面超过药材表面2～3 cm。静置30 min,使药材湿润变软,内部细胞组织变得疏松膨胀。煎煮完成后,待药液冷却,4000 r/min离心10 min,取上清液[24-26],放入 4 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2谷丙转氨酶活性的测定

查阅文献[27],在505 nm波长下,绘制谷丙转氨酶的标准曲线,拟合公式Y=-0.018234851+453.80261X-781.85836X1.5+3398.7434X2.5-2394.9714X3(X为绝对OD值,Y为ALT活力),R2>0.99。

利用新鲜猪肝制备1%的组织匀浆,以1∶10的比例加入10倍体积的药液,制成样品。参考文献中记载的方法处理样品[27],在505 nm波长下测定样品中谷丙转氨酶的活性。

1.3.3鱼腥草复方配伍的单因素试验

根据《中国药典》的推荐用量[28],准确称定充分干燥至恒定质量的葛根、鱼腥草、枳椇子和茯苓,设置药用量为3 g、6 g、9 g、12 g、15 g,自变量药材取设定的5个用量水平,其他药材取中间用量9 g,以谷丙转氨酶的活性为指标,进行单因素试验[29],每组煎煮药液做三个平行样。由此考察各自变量用量对谷丙转氨酶活性的影响。

根据多篇文献报道[30-31],基于研制解酒类功能保健品的研究目的,设置对照组。中国中药行业的老字号北京同仁堂在市场上畅销的直畅饮(葛根枳椇子压片糖果)具有显著的解酒保肝药理作用,因此,设置等量蒸馏水的空白对照组和等量葛根枳椇子压片糖果溶液的阳性对照组。用 GraphPad Pism 和 SPSS 软件进行数据分析。

1.3.4鱼腥草复方配伍的响应面优化试验

为了进一步探讨葛根-鱼腥草解酒复方的配伍比例,根据响应面实验Box-Behnken 设计原理[32],以鱼腥草(X1)、葛根(X2)、茯苓(X3)和枳椇子(X4)为自变量,谷丙转氨酶的活性为响应值,用-1,0,1 编码每一个变量的低、中、高试验水平,如表1所示。利用Design Expert 和Excel等软件对数据进行回归分析和显著性检验,确定葛根-鱼腥草解酒复方的最佳配伍比例。

表1 响应面分析因素及水平

2 结果与分析

2.1 鱼腥草复方配伍的单因素试验结果

2.1.1鱼腥草对转氨酶活性的影响

葛根、茯苓和枳椇子的用量固定为9 g,鱼腥草用量分别为3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五组单因素试验以及等量蒸馏水的空白对照组和等量葛根枳椇子压片糖果溶液的阳性对照组对谷丙转氨酶的影响结果如图1所示。

图1 鱼腥草对谷丙转氨酶活性的影响注:a～e表示0.01水平上的差异显著性

由图1可知,当鱼腥草含量较低时,谷丙转氨酶的活性水平随着鱼腥草用量的升高而降低,鱼腥草水平为6 g时,谷丙转氨酶的活性水平达到最低,为(40.58±1.15)卡门氏单位(P<0.01),继续增加鱼腥草用量,谷丙转氨酶的活性水平开始升高。这可能是由于鱼腥草含量较低时,有效成分溶出,影响谷丙转氨酶活性,当鱼腥草含量较高时,溶出成分浓度的升高降低对谷丙转氨酶的影响[33-34]。因此,鱼腥草的含量对谷丙转氨酶活性的影响显著,宜选6 g。

通过对以鱼腥草用量为自变量的单因素试验组与对照组进行差异性分析,单因素试验组对谷丙转氨酶活性的抑制效率均显著高于空白对照组,但低于阳性对照组(P<0.01)。

2.1.2葛根对转氨酶活性的影响

鱼腥草、茯苓和枳椇子的用量固定为9 g,葛根用量分别为3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五组单因素试验以及等量蒸馏水的空白对照组和等量葛根枳椇子压片糖果溶液的阳性对照组对谷丙转氨酶的影响结果如图2所示。

图2 葛根对谷丙转氨酶活性的影响注:a～f 表示 0.01 水平上的差异显著性

由图2可知,随着葛根用量的增大,谷丙转氨酶的活性水平持续降低,葛根水平为12 g时,谷丙转氨酶的活性最低,为(41.19±0.37)卡门氏单位(P<0.01),继续增加葛根用量,谷丙转氨酶的活性水平缓慢升高。这可能是由于葛根含量的增加,葛根总黄酮类成分、葛根多糖、葛根多肽等成分之间发生相互作用,对谷丙转氨酶的抑制作用降低[35]。因此,葛根的含量对谷丙转氨酶活性的影响显著,宜选12 g。

通过对以葛根用量为自变量的单因素试验组与对照组进行差异性分析,单因素试验组对谷丙转氨酶活性的抑制效率均显著高于空白对照组,但低于阳性对照组(P<0.01)。

2.1.3茯苓对转氨酶活性的影响

鱼腥草、葛根和枳椇子的用量固定为9 g,茯苓用量分别为3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五组单因素试验以及等量蒸馏水的空白对照组和等量葛根枳椇子压片糖果溶液的阳性对照组对谷丙转氨酶的影响结果如图3所示。

图3 茯苓对谷丙转氨酶活性的影响注:a～f 表示 0.01 水平上的差异显著性

由图3可知,当茯苓含量较低时,谷丙转氨酶的活性水平随着茯苓含量的升高而降低,茯苓水平为6 g时,谷丙转氨酶的活性水平达到最低,为(41.2±0.82)卡门氏单位(P<0.01),继续增加茯苓用量,谷丙转氨酶的活性水平缓慢升高。这可能是由于茯苓多糖等有效成分的溶出达到饱和,继续加大茯苓用量,有效成分相互作用,谷丙转氨酶活性水平开始升高[36]。因此,茯苓的含量对谷丙转氨酶活性的影响显著,宜选6 g。

通过对以茯苓用量为自变量的单因素试验组与对照组进行差异性分析,单因素试验组对谷丙转氨酶活性的抑制效率均显著高于空白对照组,但低于阳性对照组(P<0.01)。

2.1.4枳椇子对转氨酶活性的影响

鱼腥草、葛根和茯苓的用量固定为9 g,枳椇子用量分别为3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五组单因素试验以及等量蒸馏水的空白对照组和等量葛根枳椇子压片糖果溶液的阳性对照组对谷丙转氨酶的影响结果如图4所示。

图4 枳椇子对谷丙转氨酶活性的影响注:a～e表示0.01水平上的差异显著性

由图4可知,当枳椇子含量较低时,谷丙转氨酶的活性水平随着枳椇子用量的升高而降低,枳椇子水平为6 g时,谷丙转氨酶的活性水平达到最低,为(41.09±0.88)卡门氏单位(P<0.01),继续增加枳椇子用量,谷丙转氨酶的活性水平开始升高。这可能是由于枳椇子含量较低时,有效成分溶出,持续抑制谷丙转氨酶活性,当枳椇子含量较高时,成分之间相互作用,对谷丙转氨酶的抑制作用降低[37]。因此,枳椇子对谷丙转氨酶活性的影响显著,宜选6 g。

通过对以枳椇子用量为自变量的单因素试验组与对照组进行差异性分析,单因素试验组对谷丙转氨酶活性的抑制效率均显著高于空白对照组,但低于阳性对照组(P<0.01)。

2.2 鱼腥草复方配伍的响应面试验结果

基于单因素试验结果,对葛根-鱼腥草解酒复方的配伍比例进行响应面法优化。表1的结果用Design Expert 8.0.6软件进行多元回归拟合。响应面回归模型的方差分析结果见表2。

表2 响应面回归模型方差分析

二元回归多项式的响应面结果见图5,其中响应面和等高线形状可直观反映各因素的影响程度、交互作用及模型的极值情况,椭圆表示交互作用强,圆形则交互作用较弱。由图5可知,鱼腥草与葛根、鱼腥草与茯苓、鱼腥草与枳椇子、葛根与茯苓及茯苓与枳椇子的等高线图中心区域均呈椭圆形,说明交互作用明显。葛根与枳椇子的等高线图中心区域呈圆形,说明交互作用较弱。用Design Expert 8.0.6软件自动求解鱼腥草复方最佳配伍为:鱼腥草9 g,葛根10.85 g,茯苓3 g,枳椇子7.76 g,谷丙转氨酶活性理论预测值为32.98卡门氏单位。

图5 鱼腥草、葛根、茯苓和枳椇子交互作用对谷丙转氨酶活性影响的响应面及等高线

2.3 响应面验证试验

考虑实际操作,葛根-鱼腥草解酒复方的最佳配伍修正为:鱼腥草9 g,葛根11 g,茯苓3 g,枳椇子8 g。其他条件固定,在修正后的最佳条件下测谷丙转氨酶的活性,进行3次平行验证试验,实测谷丙转氨酶的活力为(32.82±0.63)卡门氏单位,相比于理论预测值,其差值为0.49%,表明拟合的二元多项式模型对实际工艺操作具有一定的指导和预测作用。

相比于对照组,最佳配伍比例组对谷丙转氨酶的活性高达44.58 %的抑制率,且抑制效果显著高于阳性对照组(P<0.01)。

3 讨论与结论

单因素试验的结果表明,鱼腥草、葛根、茯苓和枳椇子对谷丙转氨酶活性的影响显著(P<0.01),适宜配伍比例为:鱼腥草6 g,葛根12 g,茯苓6 g,枳椇子6 g。但通过响应面试验的进一步优化,复方的最佳配伍比例为:鱼腥草9 g,葛根11 g,茯苓3 g,枳椇子8 g,在此条件下,抑制谷丙转氨酶活性的效果最佳,为(32.82±0.63)卡门氏单位,且高于阳性对照组的抑制效果(P<0.01),可能具有良好的解酒效果。

本研究围绕大别山地区的葛根等特色药用植物资源,基于多篇文献及中医典籍以研制解酒类功能保健品的研究目的,设计了葛根-鱼腥草解酒复方,以谷丙转氨酶的活性作为指标,进行单因素试验和响应面分析试验,优化葛根-鱼腥草解酒复方的配伍比例。鱼腥草9 g,葛根11 g,茯苓3 g,枳椇子8 g的配伍比例具有显著的抑制谷丙转氨酶活性的效果,可能具有良好的解酒功效,为开发利用大别山的特色药用植物资源提供了试验依据。