不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较

冯梦珂，王星博，林璐璐，崔明仙，颜焰，周继勇*

（1.浙江大学动物医学中心，浙江 杭州 310058；2.农业农村部动物病毒学重点实验室，浙江 杭州 310058）

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种猪急性、出血性、烈性传染病，死亡率极高[1]。自20 世纪20 年代首次在肯尼亚被发现以来，ASF先后在非洲和亚欧大陆迅速传播，2018 年8 月我国辽宁省沈阳市报道首例ASF疫情，随后ASF在全国范围内大规模暴发流行[2]。由于缺乏有效的治疗手段和安全的疫苗，ASF对动物健康、食品安全、国民经济乃至生态环境都构成了持续的威胁[3]。

ASFV 基因组由一个170～190 kb 的双链DNA分子组成，病毒粒子呈现对称的二十面体结构，成熟病毒粒子包含多达68 种结构蛋白和100 多种非结构蛋白，其中结构蛋白对病毒感染研究及疫苗、诊断试剂研制的意义重大[4]。病毒粒子自外而内包括外囊膜、衣壳、内膜、核衣壳和基因组5 个部分[5]，外囊膜由EP402R基因编码的CD2v 蛋白组成。CD2v是一种与T淋巴细胞表面黏附受体CD2相似的蛋白，由信号肽（1～16 个氨基酸）、胞外区（17～207个氨基酸）、跨膜区（208～228个氨基酸）和胞内区（229～375 个氨基酸）4 部分组成[6]，CD2v 参与ASFV 宿主免疫应答、免疫逃逸和病毒复制等生理生化过程，是病毒诊断和疫苗研发的重要靶点蛋白[7]。用杆状病毒表达的CD2v 蛋白免疫可保护猪免于致死性感染[8]，而且用CD2v蛋白免疫还可诱导猪产生特异性T细胞免疫反应[9]。

真核细胞和原核细胞均可用于外源基因的表达。真核表达系统表达的重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白[10]。已有研究利用昆虫杆状病毒及CHO等真核表达系统对CD2v蛋白进行表达[11-13]，其纯化蛋白能与临床ASFV抗体阳性血清反应。大肠埃希菌原核表达系统具有操作简单方便、表达周期短且成本低、蛋白表达水平高等优点，缺点在于所表达蛋白大多为包涵体，无法形成正确的三维结构，往往无生物学活性[14-16]。多个研究小组尝试利用原核表达系统来表达CD2v蛋白，但表达蛋白主要以包涵体形式存在[17-20]，对包涵体进行溶解及镍柱亲和层析后，CD2v纯化蛋白与ASFV抗体阳性血清的免疫反应性较差[19]；而纯化的CD2v 可溶性蛋白能够被ASFV 抗体阳性血清识别，具有良好的反应原性[18]；蛋白质印迹法分析结果表明，表达的可溶性CD2v胞外区蛋白与ASFV抗体阳性血清具有良好的免疫反应性[17]。

综上所述，原核表达系统主要以包涵体形式表达CD2v 蛋白，包涵体蛋白的免疫反应性较差且纯化、复性难度较大，不利于蛋白的功能研究及应用。因此，把CD2v 蛋白与适宜的标签蛋白进行融合表达，筛选促进蛋白可溶性表达的载体，对CD2v蛋白的可溶性表达具有重要意义[21]。本研究基于5种不同的原核表达载体，筛选能促进CD2v 蛋白可溶性表达的最佳表达载体，通过临床ASFV 抗体阳性血清检测并比较可溶性CD2v 蛋白和包涵体CD2v 蛋白的免疫反应性，为原核表达可溶性CD2v 蛋白及探究其免疫原性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

高保真酶（货号P510-01）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷[isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG），货 号15529019]、DNA 标志物（货号01112376）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）产物清洁回收试剂盒（货号2101050）、DNA 凝胶回收试剂盒（货号2003050）购自杭州新景生物试剂开发有限公司；DH5α和BL21（DE3）大肠埃希菌感受态细胞由本实验室制备；原核表达载体pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T 和pCold-TF 由本实验室保存；二辛可酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白浓度测定试剂盒（货号C503021-0500）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；镍-氨三乙酸（nickelnitrilotriacetic acid, Ni-NTA）琼脂糖（货号30210）购自德国QIAGEN公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的羊抗鼠IgG（货号074-1806）、HRP标记的羊抗猪IgG（货号14-14-06）购自美国KPL公司；质粒小提试剂盒（货号DP103-02）购自天根生化科技（北京）有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯。临床ASFV 抗体阳性血清（病毒被灭活）和标准阴性血清由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 原核表达质粒的构建与鉴定

根据GenBank 数据库中公布的非洲猪瘟病毒HLJ-2018 株（登录号MK333180.1）的序列信息，由杭州尚亚科技有限公司合成去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v 蛋白（CD2vΔSP-TM）序列。将序列插入原核表达载体pET-28a，构建原核表达质粒pET28a-CD2vΔSP-TM。根据不同的原核表达载体设计引物，以pET28a-CD2vΔSP-TM 原核表达质粒为模板，通过PCR扩增CD2v序列后，将目的片段分别插入pCold-TF、pMAL-C6T、pGEX-4T-1 和pET-32a 原核表达载体，得到原核表达质粒pCold-TF-CD2vΔSP-TM、pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM、pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM 和pET32a-CD2vΔSPTM。将上述原核表达质粒转化至DH5α大肠埃希菌感受态细胞中，涂板并挑选单克隆菌落，将PCR鉴定为阳性的菌液送至杭州尚亚科技有限公司进行测序，对测序正确的阳性菌液进行质粒抽提，用于后续原核表达实验。

1.2.2 CD2v 蛋白的原核表达与鉴定

将鉴定正确的质粒转化至BL21（DE3）大肠埃希菌感受态细胞中，涂板培养后，挑取单克隆菌落接种至LB 培养基中，于37 ℃活化，将活化后的菌液按照体积比1∶100 转接至含抗生素（100 μg/mL）的LB 液体培养基中，于37 ℃、200 r/min 条件下培养约4 h，待菌液在600 nm 处的吸光度值达0.6 时，向菌液中加入终浓度为1.0 mmol/L 的IPTG，于16 ℃、120 r/min 条件下培养16 h，诱导结束后离心收集菌液，在冰浴条件下超声破碎，离心后分别吸取上清液并保留沉淀，制备样品，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）后，用考马斯亮蓝R250进行染色，以检测重组蛋白的表达情况及存在形式。各载体标签及CD2v重组蛋白分子量如表1所示。

表1 不同原核表达载体标签及重组蛋白分子量Table 1 Different prokaryotic expression vector tags andmolecular weights of recombinant proteins

1.2.3 CD2v 蛋白的纯化与鉴定

离心收集经低温诱导后的pCold-TFCD2vΔSP-TM菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）重悬后，在冰浴条件下超声破碎，离心收集上清液。将上清液与Ni-NTA琼脂糖混合，以4 ℃低温翻转孵育4 h，随后用20 mmol/L咪唑去除杂蛋白，用50 mmol/L 咪唑洗脱CD2v-TF 重组蛋白。同样，离心收集经低温诱导后的pET28a-CD2vΔSP-TM菌体沉淀，用尿素溶液（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）重悬后，在冰浴条件下超声破碎，离心收集上清液。将上清液与Ni-NTA 琼脂糖混合，以4 ℃低温翻转孵育4 h，随后用缓冲液A（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0）、缓冲液B（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 6.3）、缓冲液C（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 5.9）依次去除杂蛋白，用缓冲液D（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 4.5）洗脱CD2v-His重组蛋白。收集每次被洗脱的样品，用BCA法测定CD2v-TF和CD2v-His重组蛋白浓度，并将这2种重组蛋白保存于－40 ℃冰箱中。

纯化蛋白通过考马斯亮蓝R250 染色和蛋白质印迹法（Western blotting）进行鉴定。在蛋白质印迹法中，将经过SDS-PAGE后的纯化蛋白分别转印至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h（37 ℃），加入按体积比1∶1 000稀释的多聚组氨酸标签（His-Tag）的鼠源单抗作为一抗，37 ℃孵育1 h后，用含吐温-20 的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution with Tween-20, PBST）洗涤3次，每次5 min，然后加入按体积比1∶5 000 稀释的HRP 标记的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，用PBST洗涤后，利用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）试剂进行显色。

1.2.4 2 种CD2v 重组蛋白的免疫反应性比较

采用间接酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法比较2种CD2v重组蛋白的免疫反应性。将纯化后的2 种CD2v 重组蛋白用0.05 mmol/L PBS（pH 9.6）稀释至2 μg/mL，然后以100 μL/孔包被96 孔酶标板，每块96 孔酶标板于4 ℃过夜包被12 h，弃包被液，用200 μL/孔PBST 清洗3 次后，每孔加入200 μL 5%脱脂奶粉，37 ℃封闭1 h，然后用200 μL/孔PBST 重复清洗3次。临床ASFV 抗体阳性血清（n=5）和标准阴性血清（n=5）分别用5% 脱脂奶粉按体积比1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600 稀释后，每孔加入100 μL 稀释后的溶液，37 ℃孵育1 h，每个稀释度设3个重复。用PBST洗涤3 次后，按100 μL/孔加入经1∶2 000 稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37 ℃孵育45 min，再用PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μL 3，3´，5，5´-四甲基联苯胺（3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidine, TMB）显色液，37 ℃避光显色10 min 后，每孔立即加入50 μL 2 mol/L H2SO4，终止显色。用酶标仪测定每孔在450 nm 波长处的吸光度值，采用配对样本t检验分析相同稀释度下2种蛋白的免疫反应性差异。

2 结果与分析

2.1 原核表达质粒的构建与鉴定结果

以合成CD2v基因的质粒为模板，通过PCR 扩增得到去除信号肽和跨膜区的CD2v 序列片段，将其分别构建到pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T、pCold-TF 5 个原核表达载体中，获得原核表达质粒，然后将这些质粒转化到DH5α大肠埃希菌感受态细胞中，经过对应抗性的LB 平板筛选，挑取单克隆菌落接种于对应抗性的LB液体培养基中进行培养。以特异性引物（上游引物CD2v-F，5´-ATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAA-3´；下游引物CD2v-R，5´-TTAAATAATTCTATCTACA TGAATAAGCGA-3´）对菌液进行PCR 鉴定。结果（图1）表明，在969 bp长度附近出现目的条带。通过核酸测序确定CD2v基因序列、插入位置及开放阅读框都正确后，抽提质粒进行后续原核表达实验。

图1 重组质粒的PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification results of recombinant plasmids

2.2 CD2v 蛋白的原核表达与鉴定结果

将鉴定正确的原核表达质粒转化至BL21（DE3）大肠埃希菌感受态细胞中，经IPTG 诱导后，通过SDS-PAGE 和考马斯亮蓝R250 染色确定不同重组蛋白的表达形式。结果（图2）表明：pET28a-CD2vΔSP-TM 重组质粒（图2A）和pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2C）主要表达包涵体蛋白；pET32a-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2B）未表达CD2v重组蛋白；pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2D）同时表达包涵体和可溶性蛋白，其中以包涵体蛋白居多；pCold-TF-CD2vΔSP-TM 重组质粒（图2E）以表达可溶性蛋白为主。

图2 5种不同原核表达载体对CD2v重组蛋白表达的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of CD2v recombinant protein expression by five different prokaryotic expression vectors

2.3 CD2v 蛋白的纯化与鉴定结果

将低温诱导表达的CD2v-TF、CD2v-His重组蛋白通过超声破碎、镍柱亲和层析及洗脱等过程进行纯化，并用SDS-PAGE和蛋白质印迹法验证其纯化情况。结果表明，在预期的85 kDa附近有CD2v-TF重组蛋白阳性条带（图3），在预期的42 kDa 附近有CD2v-His重组蛋白阳性条带（图4）。

图3 CD2v-TF重组蛋白纯化结果Fig.3 Purification results of CD2v-TF recombinant protein

图4 CD2v-His重组蛋白纯化结果Fig.4 Purification results of CD2v-His recombinant protein

2.4 2 种CD2v 重组蛋白的免疫反应性比较分析

利用间接ELISA 方法检测（图5）显示，随着抗体浓度降低，抗原抗体免疫反应性呈现下降趋势。采用配对样本t检验分析在相同稀释度下2 种蛋白的免疫反应性差异，以在450 nm波长处的吸光度值表示。结果（图5）表明，在体积比1∶200和1∶400稀释度下，ASFV 抗体阳性血清与CD2v-TF 重组蛋白的免疫反应性显著高于与CD2v-His重组蛋白的免疫反应性（P＜0.05）。

图5 利用间接ELISA方法检测2种CD2v重组蛋白的免疫反应性Fig.5 Immunoreactivity of two CD2v recombinant proteins detected by indirect ELISA

3 讨论

ASF 对生猪养殖行业造成了严重的经济损失，由于尚无有效的疫苗和药物进行预防或治疗，目前只能依靠严格的生物安全措施进行防控[22]。CD2v是第一个被证实对ASFV致死性攻击具有保护作用的ASFV 蛋白，已成为DNA 疫苗、病毒载体疫苗等研究的重要靶点，在ASFV 疫苗研发中具有重大潜力[23-25]。

大肠埃希菌原核表达系统具有操作简单方便、表达量高、周期短、成本低等优点，但其表达的CD2v蛋白多以包涵体的形式存在，经尿素溶解后，蛋白空间结构被破坏而呈变性状态，空间表位丢失，导致免疫原性较差[11,26-27]，影响了其在低成本疫苗研制中的应用。本研究系统比较了5种原核表达载体不同重组标签对CD2v 蛋白可溶性表达的影响。结果表明：作为被广泛应用的pET表达系统中的2 个代表性载体，pET28a 和pET32a 均未能促进CD2v的可溶性表达；pGEX-4T-1载体虽然具有促进蛋白可溶性表达的谷胱甘肽-S-转移酶（glutathioneS-transferase, GST）标签[28]，但其仍表达以包涵体形式为主的CD2v 重组蛋白；pMAL-C6T 载体具有麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein, MBP）标签，该标签不仅能提高重组蛋白表达量，而且能减少蛋白降解并促进其可溶性表达[29]，在本研究中该标签虽然可提高CD2v 蛋白的可溶性表达，但在非变性亲和纯化过程中杂蛋白较多，影响了CD2v 蛋白的纯度；而pCold-TF 载体表达的CD2v 重组蛋白均以可溶性的方式存在，且可纯化获得纯度较高的可溶性重组蛋白。pCold-TF是一种冷休克载体，带有触发因子（trigger factor, TF）标签，而TF是原核细胞中与核糖体相关的分子伴侣蛋白，可促进多肽进行共翻译折叠表达，并通过提高蛋白的正确折叠来促进可溶性表达[30]。

4 结论

本研究构建了5 种原核表达重组质粒，比较了CD2v蛋白的可溶性表达情况，并利用临床ASFV抗体阳性血清比较了在可溶性和包涵体形式下CD2v蛋白的免疫反应性。结果表明，TF标签可有效促进CD2v蛋白的可溶性表达，且可溶性CD2v蛋白的免疫反应性显著高于包涵体蛋白，表明蛋白的可溶性表达可能在空间表位层面影响蛋白的免疫反应性。因此，选择合适的表达载体是CD2v 蛋白在原核表达系统中实现正确折叠和可溶性表达的一种有效策略。本研究为ASFV CD2v 蛋白的可溶性表达提供了参考载体，为CD2v 蛋白功能与免疫原性研究及亚单位疫苗研制奠定了基础。