宏基因组二代测序技术诊断骨髓涂片阴性婴幼儿黑热病3 例报告

谢 垒 王 瑶 马 威 范晓蕾 孙 娟 陈晓昕 王怀立

郑州大学第一附属医院儿童重症医学病区（河南郑州 450052）

黑热病又称内脏利什曼病，是杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫引起的慢性地方性传染病[1]。临床特征有持续性不规则发热、肝脾肿大、全血细胞减少、高丙种球蛋白血症和体重下降等[2]。由于黑热病临床表现无明显特异性，极易与血液系统疾病相混淆，造成误诊或漏诊。近年来随着基因组技术的发展，宏基因组二代测序技术（metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS）在指导感染性疾病的诊断和治疗中突显出重要作用[3]。本文对郑州大学第一附属医院儿童重症监护室收治的经mNGS 确诊的3例骨髓涂片阴性黑热病患儿的临床资料进行回顾性分析，探讨mNGS 在婴儿黑热病诊断中的应用价值。

1 临床资料

例1，女，1岁，居住于河南安阳林州市，因发热5 天、发现骨髓象异常1 天于2021 年4 月18 日收入院。入院前5天患儿发热，最高体温达40℃，当地医院查血白细胞计数（WBC） 4.67×109/L，血红蛋白（HB） 94 g/L，血小板（PLT）131×109/L，C反应蛋白（CRP）41.63 mg/L，予头孢类抗生素（具体不详）治疗4 d，仍反复高热。复查血WBC 4.57×109/L，HB 81g/L，PLT 46×109/L，CRP 177.57 mg/L，降钙素原（PCT）1.05 ng/mL，骨髓涂片见原始+早幼粒细胞占11%。入院体检：轻度贫血貌，全身可见散在出血点，双侧淋巴结肿大，较大者约9 mm×6 mm，边界清，肝脾肋下未触及。初步诊断为急性白血病待排。辅助检查：血WBC 3.23×109/L，HB 78 g/L，PLT 41×109/L；CRP 116 mg/L，PCT 1.87 ng/mL；谷氨酸氨基转移酶90 U/L，纤维蛋白原1.32 g/L，铁蛋白3 803.3 ng/mL，三酰甘油2.27 mmol/L；血培养阴性，EB病毒和巨细胞病毒DNA检测、血培养、骨髓涂片及培养均阴性。超声检查示双侧颈部淋巴结肿大，肝胆脾胰未见明显异常。予头孢曲松80 mg/kg，qd×4 d，美罗培南17 mg/kg，q6h×1 d，丙种球蛋白2 g/kg及对症支持治疗5 d，患儿仍反复发热。追问病史，当地近期无类似患者。

例2，男，1 岁10 月龄，居住于河南省安阳林州市，因发热12天、抽搐9天、血象异常6天于2021年12月21日收入院。入院前12天患儿发热，体温39℃，伴咳嗽、流涕，入院前9天体温升至40℃，抽搐1次，为全身强直大发作，持续2分钟缓解；入院前6天发热时再次抽搐1 次，表现同前。当地医院查血WBC 5.94×109/L，HB 100 g/L，PLT 109×109/L，CRP 72.14 mg/L，血沉 74 mm/h；外周血涂片示粒系减低；胸片示支气管肺炎。予阿糖腺苷、头孢噻肟钠抗感染治疗，效果欠佳。入院体检：颈部多个淋巴结肿大，较大约1 cm×0.5 cm，质韧，活动度可，无压痛；肝脏肋下5 cm，质软，脾肋下7 cm，质韧。初诊为血液系统疾病待排。辅助检查：血常规WBC 3.80×109/L，HB 85.8 g/L，PLT 110×109/L；CRP 59.9 mg/L，PCT 0.373 ng/mL，血沉 58 mm/h，纤维蛋白原 3.24 g/L，三酰甘油1.22 mmol/L；血培养、骨髓涂片及培养阴性。超声检查示双侧颈部淋巴结肿大，肝脾大。予拉氧头孢40 mg/kg，q12h，喷昔洛韦5 mg/kg，q12h抗感染治疗2 d，患儿仍反复发热。追问病史称当地近期有确诊黑热病患者。

例3，女，2 岁11 月龄，居住于山西省运城市，因间断发热40 天、血象异常10 天、加重3 天于2021年12 月31 日收入院。入院前40 天患儿发热，体温40℃，干咳，当地治疗后第5 天体温正常。入院前25天再次发热，体温40℃，当地治疗至第4天体温正常。入院前10 天再次发热，体温39℃。查血常规WBC 3.69×109/L，HB 91 g/L，PLT 112×109/L，CRP 66.10 mg/L，肺炎支原体IgM 阳性。当地医院予阿奇霉素、美罗培南、喜炎平、人免疫球蛋白（7.5g）、地塞米松（3 mg×2 d）、甲基泼尼松龙（40 mg×1 d，20 mg×1 d）等治疗1周，效果欠佳。入院体检：浅表淋巴结无肿大，咽部充血，心肺无异常，腹膨隆、软，肝肋下未及，脾肋缘下6 cm，质韧。初诊为噬血细胞综合征待排，流行性感冒。辅助检查：血常规WBC 1.42×109/L，HB 76 g/L，PLT 59×109/L，NE 0.44×109/L；CRP 37.8 mg/L，PCT 16.3 ng/mL，血沉 77 mm/h，纤维蛋白原 3.93 g/L，铁蛋白 2 885.5 ng/mL；乙型流感及呼吸道合胞病毒阳性；骨髓涂片示骨髓增生活跃，可见吞噬细胞，吞噬红细胞及血小板；血培养及骨髓培养阴性；腹部超声示脾大。予帕拉米韦10 mg/kg，qd×5 d，头孢哌酮钠舒巴坦钠80 mg/kg，q8h×6 d，丙种球蛋白7.5 g×2 d，地塞米松2.5 g×2 d，患儿仍反复高热。追问病史当地无类似患者。

为明确病因，经家属及本院医学科研和临床伦理委员会（批号：2022-KY-0950-002）同意后，3例患儿均行外周血病原学mNGS 检测。结果显示，例1检测到利什曼原虫属，序列数2 380，婴儿利什曼原虫种，序列数97；例2检测到利什曼原虫属，序列数21 529，婴儿利什曼原虫种，序列数7 752，杜氏利什曼原虫种，序列数9 040；例3检测到婴儿利什曼原虫，序列数2 962，杜氏利什曼原虫，序列数343。3例均未检出其他病原体。

鉴于3 例外周血mNGS 均检测到利什曼原虫， 3 例均确诊为婴儿黑热病。后续对3 例患儿进行rK39抗体检测，结果显示，例1和例3阳性，例2阴性。

3例患儿确诊后均停用原抗感染治疗，给予葡萄糖酸锑钠半支，qd肌注。例1在用药后3天体温降至正常，例2 在用药后2 天体温降至正常，例3 在用药后4天体温降至正常。例1用药疗程为10天，第7天查骨髓涂片未见异常细胞及寄生虫，血NGS 阴性，rK 39 抗体弱阳性；例2 用药疗程为14 天，第7 天外周血mNGS 检出婴儿利什曼原虫，序列数241，杜氏利什曼原虫，序列数84，院外继续用药7天，再次复查外周血mNGS 阴性；例3 用药疗程为12 天，复查外周血mNGS 阴性，rK 39 抗体阴性。3 例随访至今，均体温正常，血象正常，颈部淋巴结无肿大，肝脏肋下未触及，例1 和例2 脾脏回缩至肋下未触及，例3脾脏肋下约1 cm。

2 讨论

黑热病是一种易被忽视的人兽共患传染病，传播媒介为白蛉。利什曼原虫可通过血液进入白蛉体内，从无鞭毛体繁殖成鞭毛体。7天后白蛉叮咬人体时，鞭毛体可进入人体，破坏中性粒细胞，导致机体单核-巨噬细胞大量增生，引起疾病发生[4]。黑热病在我国主要分布于西北部，新疆维吾尔自治区、甘肃省、四川省3 个地区发病率最高，陕西省、山西省等为流行地区[4]，近几年河南省也有散在病例报道[5-6]。本组例1和例2患儿来自河南省林州市，其中例2居住地有确诊患者，例3来自山西省，两地均有散发患者。因此，对可能来自于流行地区的发热、肝脾淋巴结肿大、抗感染治疗效果差的患儿需高度警惕此病。

文献报道黑热病好发年龄以＜3岁婴幼儿居多，考虑可能与其免疫功能发育不完善相关，本组病例发病年龄与之相符[7]。临床表现以发热、肝脾肿大、外周血细胞减少多见，也可有乏力、纳差、精神萎靡等症状，缺乏特异性，极易误诊。魏荣荣等[8]在对山西省阳泉市17 例黑热病的报道中发现，有52.94%（9/17）患者误诊为感染或血液系统疾病。本组3例患儿均有发热、全血细胞减少，例2和例3有肝脾肿大，例1 和例2 早期初诊为血液系统疾病，例3 初诊为噬血细胞综合征。黑热病患儿骨髓涂片中可见大量吞噬红细胞、白细胞、血小板的吞噬型组织细胞，其吞噬细胞有单纯吞噬利杜体、吞噬利杜体和血细胞及单纯吞噬血细胞三种情况，尤其是第三种情况，是黑热病容易误诊为噬血细胞综合征的主要原因之一。本组3例患儿在入院第一时间行骨穿涂片检查，均未发现吞噬利杜体现象，未见幼稚细胞和异常细胞，结合其他实验室指标，排除血液系统疾病及噬血细胞综合征。3例患儿从发病到确诊时间为7～40 d，在确诊前也辗转多家医院就诊，抗感染等治疗无效。因此，对于长期不规则发热、全血细胞减少、肝脾肿大、贫血及抗感染治疗无效的患者，应警惕黑热病。

目前黑热病的诊断主要依靠病原学和血清学检查。脾脏、骨髓和淋巴结穿刺液镜检是确诊的金标准[4]。脾脏穿刺液镜检诊断的灵敏度和特异度均＞90%，诊断价值最高，其次是骨髓（灵敏度53%～86%）和淋巴结穿刺液镜检（灵敏度53%～65%）[4]。骨髓穿刺检查临床应用最为广泛，但也会出现假阴性的情况，原因可能是一方面由于实验技术人员对该病认识不足，未能识别出病原体；另一方面骨髓液采集位于黑热病间歇期，尽管发热期和间歇期均有利杜小体存在，但间歇期原虫数量较少且不典型，因此未能检出[9]。本组3例患儿骨髓穿刺结果均阴性，这也为前期的诊疗增加了难度。rk 39 免疫层析试纸条法具有较高的特异度和灵敏度[10]。rk39即为利什曼原虫类kinesin基因中编码39 个氨基酸的基因片段重组抗原，ELISA 或免疫层析法都是重要且可靠的检测方法[4]。本组患儿中2例rk 39 阳性，提示灵敏性高于病原学检查，与文献报道一致[11]。但在检测治疗后疾病是否复发以及区别现症者与无症状感染者[4]方面存在缺陷。

mNGS 不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观地检测样本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），对于感染性疾病的病原体研究具有极高的应用价值[12]。近年来，mNGS 已广泛应用于血液感染、呼吸道感染、骨关节感染、脑炎等方面，样本类型多样，如脑脊液、呼吸道分泌物、粪便、尿液、血液和组织等[13]。同时，mNGS 在确定罕见病因中也表现出极大的优势，如致病性钩端螺旋体[14]、日本脑炎病毒[15]、沙眼衣原体[16]等。本组3例患儿mNGS 均提示婴儿利什曼原虫感染，确诊为婴儿黑热病，为临床医师提供了快速准确的病原学诊断依据，使患儿得到精准治疗。

对于黑热病的治疗，锑剂为首选用药。但由于锑剂产生的耐药较为常见，目前国际上推荐两性霉素B 作为黑热病治疗的一线用药[4]。本组患儿均给予锑剂治疗，未出现耐药及不良反应，疗效显著。在判断患儿治疗终点时，应注意达到病原学治愈。因为患者在临床治愈的情况下，往往不能同时达到病原学治愈，容易引起黑热病复发。本组患儿在治疗过程中，分别在第7 天予mNGS 复查，根据mNGS 结果，指导后续治疗。3 例患儿均在mNGS 阴性后停药治疗，目前随访预后良好，无复发。提示mNGS 不仅在疾病诊断中具有指导价值，对指导治疗也有较强的意义。

综上所述，婴儿黑热病极易误诊或漏诊，尤其对于骨髓涂片阴性的患儿。mNGS 作为一种快速、精准的病原学诊断方法，为疑难危重的感染性疾病提供了有效的诊断支持，有助于提供精准治疗。