增味小承气汤对梗阻性黄疸大鼠肠道黏膜紧密连接蛋白-1、分泌型免疫球蛋白A及黏蛋白-2表达的影响

魏 强 赵雪谦 张 帆 孙宝房 冀海斌 陈强谱

滨州医学院附属医院 山东 滨州 256603

中药在腹部外科围手术期的应用日趋广泛。梗阻性黄疸(obstructive jaundice,OJ)是胆道外科常见的疾病,治疗上仍以外科手术为主[1],OJ的病理生理改变及手术创伤等造成了患者肠黏膜屏障功能的损伤[2],并增加了OJ患者感染相关并发症的发生率及死亡率[3]。针对OJ围手术期的病理生理变化,本研究对传统的小承气汤进行了改进,增加了黄芪、乳香、没药组成了“增味小承气汤”,临床应用已取得了良好的效果。为进一步探讨其作用机制,本研究利用OJ大鼠模型,探讨了增味小承气汤对肠膜紧密连接蛋白-1(zonulaoccludens-1,ZO-1)、分泌型免疫球蛋白A(secreted Immunoglobulin A,s IgA)及黏蛋白-2(mucoprotein-2,MUC-2)的影响,以评价其对肠黏膜屏障功能的保护价值。

1 材料与方法

1.1 实验分组 本研究的实验流程符合动物试验委员会所制订的伦理学标准。使用6周龄SPF级雄性SD大鼠40只,体质量为220～240 g(购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司),置于相同标准环境下行单笼普通饲料喂养,实验过程中均予自由饮水。本实验所用试剂信息如下:大黄、厚朴、枳实、黄芪、乳香、没药(广东一方制药有限公司),浓缩型ZO-1抗体(碧云天),浓缩型s IgA抗体(abbiotec),浓缩型MUC-2抗体(abcam),辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天),全自动生化分析仪测量(Beckman Coulter商贸有限公司)。采用随机数字表法,将实验大鼠分为正常组、假手术组、手术建模梗阻性黄疸+中药组(OJ+M组)和手术建模梗阻性黄疸组(OJ组),每组10只。

1.2 动物模型建立 麻醉后,大鼠取上腹正中手术切口,找到肝十二指肠韧带,分离胆管及门静脉。OJ+M组及OJ组在近肝门处以5-0不可吸收慕丝线结扎除门静脉外的肝十二指肠韧带内组织,以5-0带线缝针单纯缝合逐层关腹。模型建立成功后将大鼠置于室温22～26℃、相对湿度40%～70%、安静通风的环境中分笼喂养,每日记录大鼠状态。假手术组仅显露并分离胆管,同样的方法关闭腹腔。正常组同样禁食处理,但不行手术操作。

1.3 干预措施 将大黄6 g、厚朴6 g、枳实12 g、黄芪20 g、乳香6 g、没药6 g的中药配方颗粒于小烧杯中充分混匀,加80 mL蒸馏水,60℃温水浴,搅拌至颗粒溶解,冷却至室温,制作成增味小承气汤。术前1 d至术后第7 d,OJ+M组大鼠给予1 mL增味小承气汤q12 h灌胃,其他三组大鼠均同时予以等量室温蒸馏水灌胃。

1.4 观察指标及测定方法

1.4.1 观察大鼠一般情况及血清直接胆红素水平变化 术后第3、5、7 d自尾静脉取血,生化分析仪测定大鼠直接胆红素变化。

1.4.2 观察大鼠肠黏膜屏障变化 HE染色测量小肠绒毛高度及隐窝深度;免疫组化EnVision法检测肠道ZO-1、s IgA、MUC-2表达量的变化。ZO-1浓缩抗体1∶200稀释,s IgA浓缩抗体1∶300稀释,MUC-2浓缩抗体1∶200稀释,ZO-1的阳性表达产物主要位于小肠上皮细胞内近胞膜处,s IgA阳性表达产物主要位于胞浆,颜色呈现棕黄色,少量间质细胞也可着色,MUC-2主要表达于杯状细胞。

2 结果

2.1 各组实验鼠一般情况 OJ组大鼠死亡2只,术后第2天死亡1只,死亡原因为肠瘘,解剖后发现腹腔内大量黄色浑浊液体;第6天死亡1只,死亡原因为肠梗阻,解剖后发现肠管变细,内有硬块状粪便。OJ+M组和OJ组大鼠建模后48 h后均出现尿色黄色,且有加重趋势,大便颜色变浅,并于术后3 d出现皮肤黄染,活动量减少,食欲较差,精神较差。假手术组术后恢复快,24 h后饮食、精神、活动等与正常组大鼠无显著差异。血清检验发现,OJ+M组与OJ组大鼠直接胆红素水平均有明显升高,处死后打开腹腔,OJ+M组与OJ组大鼠可见肝十二指肠韧带与周围组织粘连,可见结扎部位以上的胆管明显增粗、变薄,证明模型建立成功。见表1。

表1 大鼠直接胆红素的变化

2.2 肠黏膜组织学观察 HE染色可发现,正常组与假手术组大鼠回肠黏膜绒毛结构完整整齐,肠黏膜上皮细胞呈现高柱状形态;OJ+M组大鼠回肠黏膜绒毛结构尚完整,数量较OJ组明显多,且绒毛变粗;OJ组大鼠的回肠绒毛结构欠完整,其数量及密度下降,黏膜绒毛间间隙增大,并伴有部分绒毛脱落及细胞肿胀,黏膜的腺体排列较为稀疏,杯状细胞减少明显,黏膜萎缩变薄,呈现以间质充血水肿及非特异性炎细胞浸润为主的炎症改变。如图2所示。绒毛高度的测量发现,OJ+M组和OJ组绒毛高度明显降低,组间差异具有统计学意义(F=21.16,P<0.05);两两相比,OJ+M组绒毛高度较OJ组绒毛高,且差异具有统计学意义(t=4.694,P<0.05)。隐窝深度的测量同样发现,OJ+M组和OJ组隐窝深度明显降低,组间差异具有统计学意义(F=14.91,P<0.05);两两相比,OJ+M组隐窝较OJ组深,且差异具有统计学意义(t=2.71,P<0.05)。如图1、表2。

A.正常组;B.假手术组;C.OJ+M组;D.OJ 组。

A.正常组;B.假手术组;C.OJ+M组;D.OJ 组。

表2 不同组别大鼠肠黏膜绒毛高度及隐窝深度的测量

2.3 免疫组化检测ZO-1蛋白的表达量 ZO-1阳性表达产物主要分布于粘膜上皮边缘,正常组ZO-1在黏膜的表达呈强阳性且表达连续;假手术组ZO-1在黏膜的表达呈阳性且表达较连续;OJ+M组ZO-1在黏膜的表达呈阳性且表达较连续;OJ组可观察到ZO-1的表达分布不均匀,染色较正常组变淡,线条变模糊。四组之间ZO-1的表达量差异具有统计学意义(F=6.727,P<0.05);与OJ组相比,OJ+M组ZO-1的表达量高,且差异具有统计学意义(t=2.205,P<0.05)。如图2、表3。

表3 不同组别大鼠肠黏膜ZO-1、s IgA、MUC-2的表达量

2.4 免疫组化检测s IgA的表达量 4组之间s IgA的表达量具有差异,且差异具有统计学意义(F=16.07,P<0.05) );OJ+M组与OJ组相比,s IgA的表达量具有差异,且差异具有统计学意义(t=3.214,P<0.05)。如图3、表3。

A.正常组;B.假手术组;C.OJ+M组;D.OJ 组。

A.正常组;B.假手术组;C.OJ+M组;D.OJ 组。

2.5 免疫组化检测MUC-2的表达量 统计学分析可见,四组之间MUC-2的表达量具有差异,且差异具有统计学意义(F=7.094,P<0.05);OJ+M组与OJ组相比,MUC-2的表达量具有差异,且差异具有统计学意义(t=2.393,P<0.05)。如图4、表3。

3 讨论

在肠黏膜屏障功能的研究中,ZO-1是保持黏膜通透性的重要组成部分,由ZO-1等组成的肠黏膜机械屏障能有效防止内毒素和肠道细菌移位[4-5]。s IgA是由肠黏膜固有层浆细胞产生和分泌,是肠黏膜获得性免疫的主要效应成分[6],具有抑制肠道细菌黏附、抑制抗原吸收和中和毒素等作用[7];还可在肠黏膜表面形成保护层,阻止侵入和穿透肠上皮的细菌移位,抵抗多种蛋白水解酶,并减轻局部炎症反应[8]。因此,当肠道内绝大部分s IgA缺失时,肠黏膜屏障更容易遭到破坏[9]。肠道上皮主要由吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞和内分泌细胞组成,这些细胞不断更新,保证了肠道上皮的完整性[10]。MUC是杯状细胞的主要分泌产物,也是覆盖于肠道表面黏液层的主要组成部分[11],可有效减轻肠道的过度炎性反应,对维持黏膜稳态发挥重要作用[12]。MUC-2是主要的分泌型MUC,它是肠道黏液凝胶的主要成分[13],主要功能是在胃肠道表面形成一层保护性黏液凝胶屏障,将肠上皮细胞与肠腔分离,起到保护胃肠道的作用[14]。

OJ可导致机体多方面的病理生理改变,OJ患者并发症发生率增高的因素也是多种多样的[15-16],其中肠黏膜屏障的损害是导致患者预后不良的重要因素之一。本研究发现,OJ组大鼠小肠绒毛高度及隐窝深度降低,肠道ZO-1、s IgA、MUC-2表达量减少,表明梗阻性黄疸对肠屏障功能产生损害,这与既往文献研究结果相似[17-19]。本研究模型建立后连用增味小承气汤7 d,与对照组相比,OJ大鼠小肠绒毛高度及隐窝深度明显改善,肠黏膜ZO-1、s IgA和MUC-2三种蛋白的表达增加。这证明,增味小承气汤对肠黏膜机械屏障、免疫屏障及生物屏障具有较好保护作用。

增味小承气汤可改善胆道术后患者的免疫功能和临床预后[20],此临床效果显现可能与应用增味小承气汤后肠屏障功能得到较好的保护有关。增味小承气汤是大黄、厚朴、枳实、黄芪、乳香、没药的合理配伍,弥补了小承气汤及单味中药的一些不足,对改善OJ所致肠黏膜屏障功能障碍具有更好的作用。其中药物的作用及机制研究如下:由大黄、厚朴、枳实组成的方剂小承气汤具有加快胃肠蠕动的作用[21]。黄芪可增强和调节免疫功能[22-24],乳香、没药具有止痛、促进伤口愈合的作用[25]。大黄、黄芪等中药具有保护肠黏膜屏障的作用,大黄可抑制细菌和内毒素的移位、减轻炎症反应、促进肠蠕动、保护肠道屏障功能[26-27]。动物实验及临床研究发现,大黄可改善肠道屏障功能、减少或阻止内毒素血症的发生,对减轻应激反应时的肠黏膜损伤、防止肠道菌群移位和降低全身炎症反应综合征的发生具有重要作用[28]。黄芪对免疫功能具有明显的增强和调节作用[22],能促进T细胞成熟,提高NK细胞活性,提高血清中IL-2、IL-4等的含量[29-30];傅廷亮等[31]在建立OJ幼鼠模型后,通过腹腔注射黄芪注射液,发现中、低浓度黄芪可增加OJ幼鼠血液中CD4+、CD8+细胞的水平,提示黄芪对OJ幼鼠的肠黏膜淋巴细胞免疫功能具有调节作用。乳香、没药主要发挥促进血液循环、止痛、收敛创口、促进切口愈合的作用,其效果在动物实验及临床应用中均已得到证实[32-33]。

综上所述,增味小承气汤改善了OJ大鼠的一般状况,增加了ZO-1、s IgA及MUC-2等蛋白的表达量,从而减轻了肠黏膜机械屏障、免疫屏障及生物屏障的损害,起到保护肠黏膜屏障的功能。