动物源沙门氏菌的复苏、保藏与抗药性检测

文│方杰（山东省青岛市即墨区农业农村局）

为了掌握兽医药敏试验技术，复苏与保藏了2013—2014年采集的不同动物来源的沙门氏菌共300株，采用96点阵药敏检测仪检测这些菌株对9种常用药物（氨苄西林、硫酸粘菌素、环丙沙星、恩诺沙星、硫酸新霉素、庆大霉素、头孢噻呋、多西环素、氟苯尼考）的最低抑菌浓度（MIC）。96点阵药敏检测仪根据琼脂稀释法原理，结合图像分析技术、数据库技术和互联网，构建山东省的抗药性监测网。结果显示，菌株复苏率98%；动物源沙门氏菌的抗药频率高，尤其是对多粘菌素药物，抗药率高达78.76%以上；多数菌株对4～6种药物有抗性。鸭源沙门氏菌比猪源的抗药性高，临沂地区比平度地区抗药性高。研究结果表明，沙门氏菌抗药性较普遍，应通过建立兽医抗药性监测网进行汇集和统一监管，为抗菌药物的有效使用提供依据和保障。

沙门菌属是肠杆菌科中的一个大属，是危害人类与畜禽等动物的一类重要病原菌。该菌为革兰氏阴性菌，无芽孢杆菌。禽类（特别是鸡）感染沙门菌后容易引发多种疾病，主要为鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒3种。沙门氏菌感染人类而引发的一系列疾病已经对人类的劳动生产及人类自身健康产生了极大的影响，对公共卫生安全和正常的生产秩序产生了不良影响，应引起重视。近年来，随着我国养殖业不断增长，抗生素的大量使用，使沙门氏菌的抗药性逐渐增强，这也是危害养殖业的一大隐患。

药敏试验通过采取不同形式的方法检测一系列抗菌药物对试验菌的抑制效果，并以一定的方式进行结果描述，对临床用药有指导性意义。药敏试验的常用方法有纸片法、E测定法和稀释法。在本研究中，山东省农业科学院畜牧兽医研究所根据CLSI提出了琼脂稀释法的工作原理，自主研发96点阵药敏检测仪及图像采集系统，实现了药敏检测的大通量、高效率和结果采集自动化。

一、实验材料

1.试剂。灭菌生理盐水、灭菌水，无水乙醇、PBS（pH＝6，0.1摩尔/升）；MHB肉汤、MHA肉汤、普通琼脂粉均购自北京陆桥技术有限责任公司。

2.试验设备和仪器。一次性培养皿、接种针、棉棒、纸片、酒精灯、甘油、EP管、镊子等。

3.药品。氟苯尼考可溶粉、硫酸庆大霉素可溶性粉、头孢噻呋钠、氨苄西林可溶性粉、硫酸黏菌素可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、乳酸环丙沙星可溶性粉、盐酸多西环素可溶性粉、盐酸恩诺沙星均来自亚康药业抗生素标准品。

二、试验方法

1.菌种的复苏。

（1）培养基配制。MHA平板的配制：称取MHA培养基以38克/升加入锥形瓶中，加水，摇匀，121℃、15分钟条件下进行高压灭菌后冷却至45～50℃。高压灭菌过程中将一次性培养皿在超净台中进行紫外线照射。将冷却好的MHA培养液倾注于紫外线照灭菌的一次性培养皿中。将凝固好的琼脂平板对应需要复苏的细菌进行编号。

（2）细菌培养。将细菌从-20℃保存箱里取出，室温解冻。用无菌接种针在洁净工作台中挑取菌液并划线接种于编号相同的MH琼脂培养基平皿上，需划出单菌落。划线后的MH琼脂培养基平皿放置37℃恒温箱中静置培养18～24小时。

培养结束后取出培养皿，观察是否所有培养皿细菌都生长、是否为沙门氏菌，以及没有被其他细菌污染。如果出现对应培养基中没有长菌，则需要将原来菌样放到37℃摇床中培养12小时以上，然后重新接种到培养皿中观察。

（3）细菌保存。从温箱中取出接种细菌的MHA培养皿，观察每个平皿中的细菌生长情况，选择生长良好的进行细菌保存。细菌分为两种保存方法：纸片法保存。在超净台中将灭好的2毫升EP管进行编号，跟之前细菌编号一致，一一对应；用镊子夹取灭菌过的纸片4～6片平放到细菌生长良好的MHA培养皿中，用镊子轻轻夹取纸片在培养基表面蘸取细菌，然后夹取蘸有细菌的纸片放到对应的EP管中，盖好管盖，进行下一个细菌保存。甘油肉汤保存法。取灭菌的2毫升EP管，用移液枪在每个管中加入1毫升配好的灭菌过的甘油肉汤，将EP管进行编号，与原细菌编号相同，再用高压灭菌好的棉棒在细菌生长良好的MHA培养基表面轻轻滑动，将细菌蘸取到棉棒上，将棉棒放入对应编号的甘油肉汤中，用力挤压，使细菌能够完全稀释到生理盐水中，盖紧管盖。将用纸片法保存的细菌放入冰箱中储存，将甘油肉汤法保存的细菌放入到-20℃储存，以备常用。

2.MIC的测定。

（1）药物平板的配制。将抗菌药物粉剂按照有效含量计算，判定完全抑制菌落生长的抗菌药物的浓度即为杀菌浓度，将HPLC纯度、含水量、盐的形式提供的药物活性分数都考虑在内，获得各种药物预计的终浓度溶液。

（2）用96点阵接种仪接种。选取需要测定的细菌和质控菌株，在MHA培养基上培养，方法同细菌复苏培养法。

取96点阵药敏检测仪，将高压灭菌过的96孔针安装到96点阵药敏检测仪上。取加样好的96孔菌样放置到96点阵药敏检测仪的一端，第一个接种对照组空白琼脂板，再将不同药物浓度梯度的琼脂板从低浓度到高浓度依次接种，在所有药物平板接种大约到一半数量时增加另外一个空白琼脂板作为第二个对照。将所有平板按顺序倒放在37℃恒温箱中恒温培养18～24小时。

（3）结果图像采集和MIC统计。从温箱中取出平板按顺序放好，从低浓度到高浓度排放。链接药敏图像采集仪，打开电脑中的药敏检测软件，输入相应信息，按药物浓度由16R到1/8R设置药物梯度。设备连接好后将药物琼脂培养基按不同的药物由低浓度到高浓度依次放入药敏图像检测仪中进行拍照采集，采集沙门氏菌在不同药物及同种药物不同药物浓度下的生成情况，采集结束将采集到的所有数据统一保存到数据库中做进一步处理。应注意到仪器在采集过程中可能会出现误差，需要人工检查，并及时修改。

三、试验结果与分析

1.菌株复苏与保藏。细菌在MHA培养基上基本生长良好，出现单菌落，根据单菌落的形态基本能确定是纯净的复苏前细菌，对在MHA培养基上生长良好的细菌进行保存。

细菌经过MHA培养基培养后生长良好，也有因为试验操作原因出现个别MHA培养基上的细菌没有生长，再次培养后细菌生长良好。最后，将所有生长良好的细菌在纸片保藏和甘油肉汤保藏两种保存方法下存储到冰箱中低温保藏。

2.沙门氏菌MIC测定结果。由MIC分布图可见，此次沙门氏菌对以上9种药物的敏感性有所差异，可以直观地看到对多粘菌素的抗性菌较多，抗药率为78.76%；其次是恩诺沙星的抗药率为73.07%。头孢噻呋钠的抗药率较低，为22.74%。环丙沙星、氨苄西林、新霉素和庆大霉素分布跨度比较大，抗药率分别为71.15%、57.91%、46.32%和41.71%。多西环素和氟苯尼考的抗药率分别为61.92%和46.15%。

多重抗药菌是指有多重抗药性的病原菌，是同一病原菌对三类或三类以上抗菌药物同时耐药的现象。

通过上表可以得出，本试验的200株沙门氏菌存在较高的多重耐药性，多重耐药率高达74.5%。沙门氏菌出现较高的多重耐药性，增加了治疗沙门氏菌的难度。

四、讨论

1.细菌复苏重要性。细菌的复苏是很重要的基础试验，本试验可以确保细菌活性，对研究细菌耐药性提供材料与基础。虽然细菌复苏是很简单的试验，但只有不断保留原始证据才能发现和解决问题。可以根据之前细菌抗药性的特点了解到当时的用药情况，还可以比较之前细菌跟现在细菌的抗药性，发现细菌跟药物之间存在的问题与联系。

2.96点阵药敏检测仪的优势。

在采样基数庞大的前提下，本试验运用了96点阵药敏检测仪系统进行科学的药敏试验，得到样本的具体MIC，简便快捷。比起微量肉汤稀释法更加节约成本，节省资源，简单高效，科学准确；比起纸片扩散法测量抑菌圈直径，这种方法可以得到具体的MIC值，方便给临床选药和确定用量提供更直接的理论依据。而连接计算机设备的数字化读数方法更是将主观误差减到最小。

96点阵药敏检测仪的创新与使用实现了药敏检测大通量、高效率和准确度高的目标，减小了人为误差，可准确、高效地收集大量数据并保存。96点阵药敏检测仪将渐渐取代原始的药敏检测方法，但96点阵药敏检测由微量肉汤检测法不断演变而来，依然没法完全包含微量肉汤检测法的全部优点，所以96点阵检测仪依然在不断改进和创新。

3.抗药性监测技术体系的建立。抗生素是治疗动物疾病的重要产品，但长期滥用抗生素会使病原菌产生抗药性，在畜产品和环境中也会有大量残留，因此，建立完善的抗药性监测技术体系势在必行。

表1 动物源沙门氏菌多重抗药情况