基于AHP-熵权TOPSIS 混合加权法探究姜半夏化学成分与颜色的关联性

史 可，王春燕，王梦珂，王梦伟，马彦江，陈天朝,*

（1.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450008；2.河南中医药大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450000）

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎，性温、味辛，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，首载于《神农本草经》，列为下品[1]。生半夏有毒，因此临床入药多炮制，常见炮制品有清半夏、姜半夏和法半夏。清半夏炮制以白矾作辅料，化痰作用增强；姜半夏炮制以生姜和白矾作辅料，增强止呕作用；法半夏炮制以甘草和石灰作辅料，止咳作用增强，且具有调和脾胃之功效[2]。研究发现半夏中含有生物碱类、有机酸类、挥发油类、甾醇类等多种化学成分[3]，具有镇咳、平喘、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗溃疡、抗早孕等药理作用[4]。

“辨状论质”是以外观性状—形色气味质为基础，依靠眼观、鼻闻、口尝等感官技术来鉴别中药真伪优劣及质量评价的传统方法[5]，其中，色泽是判断中药品质最直观的外在特征[6]。半夏炮制后色泽加深，2020 年版《中国药典》对姜半夏颜色的描述为“表面棕色至棕褐色”，炮制过程中颜色的变化与内在化学成分含量密切相关，但仅凭肉眼观察表面颜色不足以判断其炮制程度，故本实验采用薄层成像仪结合MATLAB 软件对姜半夏饮片的颜色值进行客观量化表达，并且采用AHP-熵权TOPSIS 混合加权法进行多指标综合评价，旨在分析姜半夏中皂苷、有机酸类化学成分含量与颜色值的相关性，以期为姜半夏炮制程度的判断及质量评价标准的建立提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TLC VISUALIZER2 型薄层成像仪（瑞士卡玛公司）；Thermo Evolution 201 型紫外-可见光分光光度计（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Agilent1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；YX-24LDJ 型手提式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）。

1.2 材料

半夏（批号：190601，河南省青山药业股份有限公司），经河南中医药大学第一附属医院陈天朝主任药师鉴定符合2020 年版《中国药典》（一部）饮片项下收载品种规定；十二水合硫酸铝钾（批号：180607，郑州派尼化学试剂厂）；齐墩果酸对照品（批号：HA0820KA14，纯度≥98%）、琥珀酸（批号：Z18D6H7816，纯度≥98%）、草酸（批号：Z15S9Y70497，纯度≥98%）、苹果酸（批号：Z29O10H101559，纯度≥98%）、柠檬酸（批号：SM0425GA14，纯度≥98%），均购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇（Sigma 试剂有限公司，色谱纯）；冰乙酸（烟台市双双化工有限公司，分析纯）；香草醛（天津市福晨化学试剂厂，分析纯）；正丁醇（天津市永大化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 姜半夏样品的制备

通过查阅2020 年版《中国药典》、各地方炮制规范及文献资料，采用混合均匀设计考察白矾用量、生姜用量、蒸煮时间、蒸煮温度4 个因素，取生半夏饮片，大小分档后用无菌水洗净，20℃恒温条件下，以不同白矾用量浸泡至无干心（浸泡时使用无菌水量为饮片量的4 倍），再取不同用量的生姜，捣碎后加入，用高压锅蒸汽灭菌锅蒸制后，低温干燥，即得样品。混合均匀设计见表1。

表1 姜半夏炮制品U8(83×4)混合均匀设计表Tab.1 U8(83×4) mixing uniform design table of Ginger Pinellia gun product

2.2 颜色值的测定

2.2.1 采集图像 取姜半夏不同炮制品饮片分别置于透明干净培养皿背面，放入薄层扫描仪中，反射光照射，进行图像采集。

2.2.2 RGB 数据采集及HSI 数值转换 利用MATLAB R2016 软件，通过程序代码依次分析采集好的图像，分别生成RGB（红绿蓝）图像，从每个样品RGB 图像中均匀选取30 个（R，G，B）点，以此30 个值计算平均值，然后将平均值进行HSI 转换，得到（H，S，I）数据[7]。H表示色调，描述的是可见光中不同光被混合而成的颜色；S表示饱和度，描述颜色的深浅程度，饱和度越高，颜色越深；I表示明亮程度，符合人眼对物体接受光照时的认知，其值越大，越明亮[8]，颜色值测定结果见表2。HSI 与RGB 转换公式如下：H=θ(B≤G)或2π-θ(B＞G)；θ= arccos{1/2 [(R-G)+(R-B)]/[(R-G)2+(R-B)(G-B)]1/2}；S= 1-3[min(R,G,B)]/(R+G+B)；I＝1/3(R+G+B)。

表2 姜半夏饮片颜色值的测定结果Tab.2 Determination of color value of Ginger Pinellia decoction pieces

2.3 姜半夏中有机酸类成分的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸对照品16.03 mg、15.66 mg、15.66 mg、17.60 mg，用NH4H2PO4（pH = 2）溶液定容至5 mL 容量瓶中，摇匀，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取姜半夏不同样品细粉0.5 g，加水50 mL，超声60 min，放冷后称定，补足失重，摇匀，取续滤液5 mL，加磷酸溶液0.5 mL，摇匀，加乙酸乙酯萃取，25 mL/次，萃取5次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩至干， 加0.1%磷酸溶液溶解，转移至5 mL 容量瓶中，定容至刻度，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3.3 色谱条件 ZORBAX SB-Aq 色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相为0.03 mol/L 磷酸二氢铵（pH =2.0）：甲醇（97 : 3）；流速为0.8 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。

2.3.4 线性关系考察 吸取混合对照品溶液，制备成一系列梯度质量浓度的溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件进行测定，以对照品浓度（X，mg/mL）为横坐标，半夏样品峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程见表3。

表3 标准曲线考察结果Tab.3 Results of standard curve investigation

2.3.5 精密度试验 精密吸取混合对照溶液，按“2.4.3”项下条件连续进样6 次，每次10 μL，记录峰面积，结果草酸、柠檬酸、D-苹果酸、L-苹果酸、琥珀酸RSD 值分别为0.27%、0.07%、0.10%、1.05%、0.39%，均小于2%，表明此仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.4.3”项下条件进样，于0、2、4、6、8、12、24 h 不同时间点进行测定，结果草酸、柠檬酸、D-苹果酸、L-苹果酸、琥珀酸RSD 值分别为1.65%、2.76%、1.60%、4.43%和4.77%，表明该供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 精密称取同一样品粉末6 份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下条件进样，依据峰面积计算RSD 值。结果草酸、柠檬酸、D-苹果酸、L-苹果酸、琥珀酸RSD 值分别为1.54%、3.79%、4.46%、4.15%和2.06%，表明该测定方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取6 份样品粉末，每份0.5 g， 按“2.4.2”项下制备供试品溶液，精密加入对照品溶液适量，按“2.4.3”项下条件测定，记录峰面积，计算RSD 值。结果草酸、柠檬酸、D-苹果酸、L-苹果酸、琥珀酸RSD 值分别为2.72%、1.35%、3.54%、1.52%和3.65%，所测得草酸、柠檬酸、D-苹果酸、L-苹果酸、琥珀酸的平均回收率分别为98.02%、99.21%、95.59%、97.35%、94.87%，表明此方法准确度较好。

2.3.9 含量测定 按照“2.4.2”项下供试品溶液制备方法，并按“2.4.3”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算有机酸类成分含量，结果见图1、表4。

图1 姜半夏中有机酸类成分的HPLC 图Fig.1 HPLC diagram of organic acids in Ginger Pinellia

表4 半夏生品及姜半夏炮制品化学成分含量测定结果（mg/g）Tab.4 Chemical composition determination results of Pinellia Raw products and Ginger Pinellia products (mg/g)

2.4 姜半夏中皂苷的含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备 取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇配制成1 mg/mL 的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 精密称定1 g 姜半夏不同炮制品细粉，置于锥形瓶中，加水饱和正丁醇20 mL，称重后密塞，浸泡12 h，超声60 min 后离心，精密量取上清液15 mL，蒸干溶剂后加甲醇溶解残渣，定容至10 mL 容量瓶中，即得供试品溶液。

2.4.3 建立显色条件 精密量取齐墩果酸对照品与供试品溶液1 mL，置具塞试管中，挥干溶剂后加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，再加入高氯酸0.8 mL，摇匀，置60℃水浴15 min 后取出，再置冰水浴中，冷却后取出，加入5 mL 冰乙酸。以相应试剂为空白，在400 ～ 800 nm 范围内扫描最大吸收波长，结果显示在543 nm 处有最大吸收。

2.4.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品溶液0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4 mL，定容于5 mL 容量瓶中，配制成0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28 mg/mL 的对照品溶液，按“2.3.3”项下操作，在最大吸收波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，对照品的浓度（X，mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=4.151 4X-0.050 6，R2=0.999 6，结果表明齐墩果酸在0.080 0～0.280 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4.5 精密度试验 精密量取齐墩果酸对照品溶液0.16 mg/mL，按“2.3.3”项下进行操作，在543 nm 最大吸收波长处连续测定6 次，计算RSD 值。经计算RSD 为0.18%，表明此仪器精密度良好。

2.4.6 重复性试验 精密称取姜半夏粉末6 份，每份1.0 g，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下方法测定其吸光度值（A），计算RSD 值。经计算RSD 为0.32%，表明该方法重复性良好。

2.4.7 稳定性试验 以姜半夏粉末为样品，按“2.3.2”项下方法操作，分别于0、10、20、30、40、50、60 min，按“2.3.3”项下方法处理，测定吸光度值（A），计算RSD 值。经计算RSD 为1.06%，表明该供试品溶液在60 min 内稳定性良好。

2.4.8 加样回收率试验 精密称取6 份样品粉末，每份1.0 g，按“2.3.2”项下制备供试品溶液，加入适量对照品，按“2.3.3”项下方法进行操作，测定其吸光度值（A），计算RSD 值。经计算平均加样回收率为98.99%，RSD 为1.58%，表明此方法准确度较好。

2.4.9 含量测定 精密量取各供试品溶液，按“2.3.3”项下方法处理，在543 nm 最大吸收波长处测定吸光度值（A），计算半夏不同炮制品中皂苷含量，结果见表4。

2.5 AHP-熵权TOPSIS 混合加权法确定指标权重

2.5.1 AHP 法确定各指标成分权重 层次分析法(AHP)是一种定性、定量相结合，系统化、层次化的主观赋权分析方法[9]。本研究依据半夏炮制前后各成分含量增减变化和药理活性，将指标分为5 个层次，确定其各指标顺序为皂苷＞L-苹果酸=D-苹果酸＞草酸＞柠檬酸＞琥珀酸，据此构建各指标成对比较的判断优先矩阵，见表5。

表5 姜半夏评价指标的判断优先矩阵Tab.5 Judgement priority matrix of Ginger Pinellia evaluation index

利用SPSSAU 软件（https://spssau.com），选择综合评价中的AHP 层次分析，计算得出皂苷、L-苹果酸、D-苹果酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸的权重系数分别为0.263 2、0.210 5、0.210 5、0.157 9、0.105 3、0.052 6，显示最大特征根为6.000，一致性指标CI 为0.000，得到随机一致性指标RI 为1.260，一致性比率因子CR =0.000 ＜ 0.10，说明所得各指标权重具有一致性。

2.5.2 熵权TOPSIS 法确定各指标成分权重 熵权TOPSIS 法是一种融合熵值法与TOPSIS 法的综合评价方法[10]。利用SPSSAU 在线软件（https://spssau.com）对数据进行“标准化”处理，再进行“熵权TOPSIS”分析计算得出皂苷、L-苹果酸、D-苹果酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸的权重系数分别为0.124 9、0.388 1、0.211 1、0.106 6、0.067 7、0.101 5。

2.5.3 AHP-熵权TOPSIS 法确定各指标成分综合权重 AHP-熵权TOPSIS 法是从主观和客观两方面综合考虑，更加合理地计算权重系数，计算公式为ω综合ij=ωAHPij×ω熵权TOPSISij/Σ（ωAHPij×ω熵权TOPSISij)，经计算得出皂苷、L-苹果酸、D-苹果酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸的综合权重分别为0.174 6、0.433 8、0.236 0、0.089 4、0.037 9、0.028 4。

2.5.4 三种权重分析方法综合评分的比较 用上述3 种权重系数计算实验数据的综合评分（Y），Y=(Y1i/Y1max) 权 重100+(Y2i/Y2max) 权 重100+…+(Y6i/Y6max)权重100，结果见表6，采用SPSS21.0 软件对3种综合评分进行相关系数分析，结果显示AHP 法和熵权TOPSIS 法综合评分相关系数为0.978（P＜0.01），AHP 法和AHP-熵权TOPSIS 法综合评分相关系数为0.992（P＜0.01），熵 权TOPSIS 法 和AHP-熵 权TOPSIS 法综合评分相关系数为0.992（P＜0.01），相关性均极显著，说明3 种权重系数计算所得的综合评分结果一致。AHP 法和熵权TOPSIS 法权重系数的相关系数为0.471（P＞0.05），两者相关性比较差异无统计学意义，表明这两种计算方法所得权重系数反映的信息不具有叠加性，说明AHP-熵权TOPSIS 法结合计算权重系数可行，故本研究选择该法确定指标权重并计算综合评分。

表6 三种权重系数综合评分Tab.6 Comprehensive scores of the three weight coefficients

2.6 姜半夏颜色值与化学成分、综合评分的相关性分析

采用SPSS 21.0 软件对姜半夏炮制品的颜色值、化学成分、AHP-熵权TOPSIS 法所得综合评分进行Pearson 相关性分析，结果显示色调H与皂苷、D-苹果酸、L-苹果酸、综合评分均呈显著正相关；饱和度S与D-苹果酸、L-苹果酸、综合评分均呈显著负相关；亮度I与皂苷、柠檬酸、D-苹果酸、L-苹果酸、综合评分均呈显著正相关，见表7。

表7 相关性分析表Tab.7 Correlation analysis table

2.7 姜半夏颜色值与化学成分的回归分析

2.7.1 皂苷含量与H、I的逐步回归分析 以皂苷含量为因变量，以H、I为自变量，选择逐步stepwise法，进行逐步回归分析，余下显著自变量亮度I于模型中，得出回归模型为：Y(皂苷)=0.261+3.110X(I)，R2=0.930，P＜0.05，表明该模型具有统计学意义，而且模型通过F检验(F= 93.013，P＜0.05)，说明模型有效，并且I会对皂苷产生显著的正向影响。

2.7.2 柠檬酸含量与I的线性回归分析 以柠檬酸含量为因变量，以I为自变量，得出回归模型为：Y(柠檬酸)=-1.046+2.371X(I)，R2=0.564，P＜0.05，表明该模型具有统计学意义，模型通过F检验(F= 9.039，P＜0.05)，说明I会对柠檬酸产生显著的正向影响。

2.7.3 苹果酸含量与H、S、I的逐步回归分析以D-苹果酸含量为因变量，以H、S、I为自变量，选择逐步stepwise 法，进行逐步回归分析，余下显著自变量亮度I于模型中，得出回归模型为：Y(D-苹果酸)=-2.470+4.266X(I)，R2=0.917，P＜0.05，表明该模型具有统计学意义，并且I会对D-苹果酸产生显著的正向影响；以L-苹果酸含量为因变量，以H、S、I为自变量，选择逐步stepwise 法，进行逐步回归分析，余下显著自变量亮度I于模型中，得出回归模型为：Y(L-苹果酸)=-2.899+4.915X(I)，R2=0.924，P＜0.05，表明该模型具有统计学意义，并且I会对L-苹果酸产生显著的正向影响关系。另外，针对模型的多重共线性进行检验发现，两个模型中VIP 值均小于5，意味着不存在共线性；并且D-W 值在数字2 附近，说明两个模型均不存在自相关性，样本数据之间没有关联关系，两个模型均较好。

2.7.4 综合评分与H、S、I的逐步回归分析 以综合评分为因变量，以H、S、I为自变量，选择逐步stepwise 法，进行逐步回归分析，余下亮度I一项显著自变量在模型中，得出回归模型为：Y(综合评分)=-118.069+236.312X(I)，R2= 0.945，P＜0.05，表明该模型具有统计学意义，而且模型通过F检验(F= 119.145，P＜0.05)，模型有效。

3 讨论

半夏属于天南星科，天南星科药材具有相同的毒性作用物质基础-草酸钙针晶和凝集素蛋白[11]。历代医学古籍当中均有记载姜制的炮制方法，以中药七情“相畏、相杀”为理论依据，是采用辅料生姜炮制以减轻半夏的毒性。现代研究辅料白矾在炮制中的作用有三方面[12]，一是白矾在水中形成凝胶状态的氢氧化铝，具有一定吸附毒性物质的作用和中和作用；二是白矾在水中电离为SO42-离子，与不溶性物质草酸钙反应，逐渐破坏草酸钙针晶的形态结构，使其达到减毒的作用；三是因其复制法炮制多流程长时间浸泡的特点，浸泡过程容易腐烂发霉，而辅料白矾作为炮制辅料在减毒的同时还兼具一定的防腐抗菌作用。

中药内在化学成分复杂，通常“多指标、多靶点、多途径”协同产生作用，因此评价指标选取应多元化。皂苷是苷元为三萜或螺甾烷类的一类较复杂的糖苷类化合物，长期以来被认为是中药的关键成分，存在于多种中药材中[13]，具有多种生物活性，如抗菌、镇静、抗癌、溶血等。有机酸类成分是止咳、平喘和止呕的重要活性成分，并能够抑制癌细胞的增长[14]。颜色是评价炮制品的炮制程度及质量优劣的重要指标，相关性分析显示姜半夏内在化学成分含量与颜色存在显著相关性，逐步回归分析构建的4个回归模型（P＜0.05），表明在93.0%的程度上可依据亮度I预测皂苷含量，在56.4%的程度上可依据亮度I预测柠檬酸含量，在91.7%的程度上可依据亮度I预测D-苹果酸含量，在92.4%的程度上可依据亮度I预测L-苹果酸含量，所以依据姜半夏外观颜色的量化数据预测其化学成分含量具有一定的可行性。综合评分与色调H呈显著正相关，即色调越低、炮制品颜色越接近暖色调，则综合评分越高，这与传统经验性评价标准一致，综合评分与亮度I呈显著正相关，即综合评分越高，炮制品颜色越亮，越接近棕色，这与姜半夏炮制时的颜色变化过程保持一致。回归模型表明在94.5%的程度上可依据亮度I预测姜半夏整体质量。

4 结论

本研究测定了姜半夏的化学成分含量和色度值，色度值客观量化表征其外观颜色，AHP-熵权TOPSIS 混合加权法进行综合评分，分析其成分含量及综合评分与颜色值的相关性并建立回归模型，对姜半夏炮制品质量评价及炮制程度判断的客观化具有参考意义，为中药炮制的数字化生产提供一定的参考依据，后期还需进一步加大样本量以验证模型准确性。