基于Illumina 平台mNGS 技术在老年社区获得性肺炎肺泡灌洗液病原学诊断中的应用

李兴明 谢秀芳 王宪刚 李云 罗进 何珍 邓魏岚 胡晓菁

社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）是指在院外感染病原体或在明确潜伏期入院48 小时内发生的肺实质和肺间质的感染性炎症［1］。老年人由于身体机能下降免疫功能衰退，又往往伴随多种基础疾病，而成为CAP 的易感人群，并且随着年龄增长感染率呈上升趋势。CAP 病原菌种类繁多，病原体变异程度大，对常用抗生素耐药性逐年增加，给临床治疗带来了极大的压力，老年重症CAP 患者病死率高达40%［2］。因此快速、准确找到病原体种类，给予对应的抗菌药物对提高患者生存率，缩短治疗周期，改善预后至关重要。目前临床常用的病原体检测方法是传统的细菌培养鉴定法，该方法准确性较高［3］，但检测时间长，容易错过最佳的治疗时间窗。基于Illumina平台宏基因组二代测序（Second generation sequencing of genome，mNGS）是一种基于基因组学的高通量病原学检测方法，能在短时间内对样本所有核酸片段进行检测，精准识别病原体信息，大部分检测在24 小时内完成，是一种高效灵敏的微生物检测方法［4］。本研究通过比较传统细菌培养法和基于Illumina 平台mNGS 对肺泡灌洗液病原体的检测结果，分析其对老年CAP 临床诊断的应用价值。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取2022 年1 月至2022 年6 月内江第一人民医院收治的疑诊老年CAP 患者200 例为研究对象，其中男105 例，女95 例，平均（74±7.51）岁。纳入标准：①符合中华医学会呼吸病学分会制定的中国成人医院CAP 与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018 年版）诊断标准［5］，患者出现发热、咳嗽、浓痰症状，白细胞计数＞10×109L 或＜4×109L，胸部X 片检查出现片状、叶状、肺泡高密度浸润性病变；②年龄＞60 岁；③以CAP 为第一诊断，病程小于48 小时；④生命体征平稳，意识清醒，有一定的表达能力。排除标准：①合并严重免疫系统，血液系统疾病，恶性肿瘤，全身疾病急性期；②严重的心、肝、肾、肺部疾病；③活动性肺结核，非病原体感染导致的肺部炎症，支气管扩张；④其他原因住院患者继发性感染。研究经患者或其家属知情并签署知情同意书，本研究已获得本院伦理委员会批准。

1.2 试剂和仪器

MAPMITM超广谱病原微生物mNGS 检测试剂盒（北京博奥晶典生物技术有限公司），呼吸道病原菌核酸提取试剂盒（北京博奥晶典生物技术有限公司），采用NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒（新英格兰生物实验室公司）用于构建Illumina测序文库，采用Nextseq 550 DX 测序仪（美国因美纳公司）用于测序。血平板、万古霉素巧克力平板、麦康凯平板（广东环凯生物科技有限公司），VITEKⅡ-Compact 细菌分析系统（法国梅里埃生物）。

1.3 方法

收集患者肺泡灌洗液3 mL，在2～8℃中保存，24 h 内完成核酸提取与培养板接种。基于Illumina平台mNGS 检测法采用呼吸道病原菌核酸提取试剂盒，按照说明书的方法完成患者肺泡灌洗液中核酸的提取，采用Nextseq 550 DX 测序仪完成样品核酸检测，测序数据通过SNAP 与NCBI nt 数据库进行比对确定病原体组成。传统细菌培养鉴定将患者肺泡灌洗液接种分别接种与血平板、万古霉素巧克力平板、麦康凯平板上，置于35℃、5% CO2环境中培养24 及48 h，观察培养板菌落，筛选可能致病菌，采用VITEKⅡ-Compact 细菌分析系统进行鉴定。根据患者临床表现、胸部CT、胸部X 线、生物标志物检测、病原学检查等多方面因素对患者进行临床综合诊断，并以临床综合诊断结果为金标准。

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0 及Medcalc15.2.2 进行统计分析。计量资料以（）表示，进行t检验，计数资料用n（%）表示，进行χ2检验，采用Kappa 检验进行一致性分析，Kappa 值为0.75～1 表示一致性较好，0.4～0.75 表示一致性中等，＜0.4 表示一致性不佳，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测病原体分布情况

基于Illumina 平台mNGS 法共检出262 株病原体，其中细菌127 株、病毒96 株、真菌37 株、肺炎支原体29 株、肺炎衣原体15 株，传统细菌培养鉴定共检出169 株病原体，其中细菌139 株、真菌30 株。见图1。

图1 两种方法检测病原体分布情况Figure 1 Distribution of pathogens detected by two methods

2.2 两种方法阳性检出率、混合感染检测率及检测时间比较

基于Illumina 平台mNGS 阳性检出率、混合感染检测率较传统细菌培养鉴定高，差异有统计学意义（P＜0.05），检测时间较传统细菌培养鉴定短，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两种方法阳性检出率、混合感染检测率及检测时间比较［n（%），（）］Table 1 Comparison of positive detection rate，mixed infection detection rate and detection time of the two methods［n（%），（）］

表1 两种方法阳性检出率、混合感染检测率及检测时间比较［n（%），（）］Table 1 Comparison of positive detection rate，mixed infection detection rate and detection time of the two methods［n（%），（）］

2.3 两种方法检测一致性比较

基于Illumina 平台mNGS 与传统细菌培养鉴定一致性分析显示，Kappa 值为0.329，检查结果一致性不佳。见表2。

表2 两种方法检测病原体一致性比较［n（%）］Table 2 Comparison of pathogen consistency between the two methods［n（%）］

2.4 基于Illumina 平台mNGS、传统细菌培养鉴定与临床诊断效力比较

以临床诊断为金标准，临床诊断老年CAP 患者186 例，非老年CAP 患者14 例，200 例疑诊老年CAP 患者肺泡灌洗液基于Illumina 平台mNGS 法检测特异度、灵敏度分别为85.71%、97.31%，较传统细菌培养鉴定的80.64%、71.43%高。见表3。

3 讨论

CAP 致病病原体包括多种细菌、真菌和病毒，其中较为常见的是肺炎链球菌、肺炎支原体等［6］。老年人常伴有心血管疾病、慢性呼吸道疾病等，呼吸道弹性下降，纤毛运动减弱，气道清除能力降低，病原体容易聚积繁殖，引起老年CAP，其带来的炎症反应和细菌毒素会诱发心肌损伤，加重患者基础疾病［7］。病原体变异快，耐药性增加使老年CAP 的治疗难度加大，因此早期快速准确识别患者病原体种类，有助于缩短治疗时间，提高治疗效果，改善老年CAP 预后。与传统细菌培养鉴定相比，mNGS 灵敏度更高，检测时间更短，通过核酸序列的比对，快速识别多种病原体，为临床治疗提供有力依据［8］。但mNGS 只能对DNA 分子进行测序并且产生相对较短的读数，而RNA 病毒也构成了很大一部分CAP 病原体，基于Illumina 平台mNGS 检测技术在传染性病原学检测，尤其是罕见或新兴病原体中表现出更大的优势，基于Illumina 平台mNGS 在老年CAP 诊断的应用研究将使CAP 的临床诊断进入分子诊断领域［9］。

基于Illumina 平台mNGS 采用高通量的核酸测序，可以短时间获得大量病原序列信息，通过基因型分析和表型分析，可以快速识别病原体耐药相关靶点，以指导临床抗菌药物的使用［10］。本研究结果显示，在200 例老年CAP 患者肺泡灌洗液中，基于Illumina 平台mNGS 检测出226 例病原体，远超传统细菌培养。细菌感染是老年CAP 感染中最常见的病原体，当发生严重的细菌感染时，患者会出现脓毒症，引起全身性的炎症反应和器官衰竭［11］。因此，早期确定病原体至关重要，传统的细菌培养鉴定需要4 天左右，检测时间长，影响治疗效果，并且细菌培养需要特定的培养环境，病原筛选范围有限，对罕见菌种检出率较低［12］。与传统细菌培养鉴定相比，基于Illumina平台mNGS 在老年CAP 肺泡灌洗液细菌、真菌、病毒的检测灵敏度更高，检测时间更短。此外，基于Illumina 平台mNGS 可检测出鹦鹉热衣原体、α 疱疹病毒、米勒链球菌等非典型病原体，对急性和危重症患者的病原学诊断具有重要意义［13］。以患者临床诊断为金标准，基于Illumina平台mNGS 检测特异度及灵敏度均高于传统细菌培养鉴定。传统细菌培养鉴定病原体需要特定的培养环境，鉴定结果受主观检测目的干扰，具有一定的局限性。真菌感染通常没有典型的临床特征，病原学检测往往有遗漏的情况，但其感染危害性极大，早期识别和诊断极其重要。而病毒感染临床症状较为典型，然而病毒变异程度大，传统的病原学检测难度极大。基于Illumina 平台mNGS 不依赖于培养实验，在病原微生物死亡后一段时间内，DNA 仍保持活性，通过对样本中核酸的提取和检测，明确样本中全部病原体核酸信息。与传统细菌培养鉴定相比，基于Illumina 平台mNGS 对常见病原菌和罕见病原菌均能快速识别，准确度较高，在病原体感染早期提供致病微生物信息，无偏倚识别混合感染［14］，可以指导临床合理使用抗生素，降低经验用药带来的耐药性增加，帮助实现精准治疗，减少患者治疗成本，提高治疗有效率，与传统细菌培养鉴定相比，具有较高的灵敏度和特异度。

综上所述，基于Illumina 平台mNGS 可以提高老年CAP 病原学诊断的准确，缩短检测时间，对早期明确病原体种类合理使用抗菌药物有重要作用，可以进一步优化老年CAP 的诊断和治疗方式，具有较高的临床应用价值。