槐耳通过PI3K/AKT信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡

温璐雯，冯 琦，霍明一，柳 新，程 玉，郑纪宁*

（1.承德医学院病理教研室，河北承德 067000；2.承德医学院基础医学研究所；3.承德医学院附属医院）

国际癌症研究机构最新数据示，结直肠癌的发病率在全部恶性肿瘤中位居第三，致死率位居第二[1]。结直肠癌的治疗通常以手术结合化疗或单独化疗[2,3]。但化疗严重的毒副作用常使患者难以耐受，寻找低毒性的药物迫在眉睫。槐生拜尔孔菌俗称槐耳，在我国有一千六百多年的用药史[4,5]。现已知槐耳对多种肿瘤都有抗癌作用[6-10]，临床上已用于肝癌的辅助化疗[11,12]。且槐耳副作用低、不易耐药等优点更是受到人们的广泛关注[13]。

PI3K/AKT信号通路与增殖凋亡密切相关，PI3K亚基活化激活AKT，进而影响凋亡蛋白和增殖蛋白表达[14]。凋亡在肿瘤的发生发展中起至关重要的作用，常表现为凋亡抑制[15]。因此，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的关键思路。本研究主要探讨槐耳对结直肠癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所使用的人结直肠癌细胞HCT8和HT29细胞系、HCT8专用完培、胎牛血清和RPMI-1640培养基均购买自普诺赛公司。槐耳原液制备取2 g槐耳颗粒（江苏启东盖天力医药有限公司），溶于20 mL 1640培养基，涡旋振荡器震荡10 min，充分混匀后用0.22 μm过滤器（美国密理博公司）过滤除菌，从而获得100 mg/mL槐耳原液，分装密封好储存于-40℃冰箱。Cell Counting Kit-8（CCK8）购自MCE公司。凋亡检测试剂盒购自中国四正柏公司。抗体包含：β-actin、AKT、p-AKT（中国Affinity公司）、BAX、BCL-2、山羊抗鼠、山羊抗兔（美国Abclonal公司）、P85α、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CyclinD1、CDK4（美国ProteinTech Group公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HCT8置于10%专用完培，HT29置于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 ℃、5% CO2的潮湿空气培养箱中培养。

1.2.2 细胞增殖实验 取对数生长期的细胞以每孔约5000个细胞种于96孔板，共设6组，分别是HCT8（0、9、12、15、18、21 mg/mL）和HT29（0、6、9、12、15、18 mg/mL），每组设3个复孔，弃上清加入相应槐耳浓度的10%完培继续置于培养箱培养，24 h后弃上清，加入CCK8工作液：每孔10 μL CCK8和100 μL 1640培养基混匀，置于培养箱培养2 h后用酶标仪检测460 nm处吸光值。加入同前一样槐耳浓度的10%完培后放于培养箱培养24 h，再次同前一样测吸光值。存活率=（实验组吸光值-空白组吸光值）/（对照组吸光值-空白组吸光值）

1.2.3 流式细胞术 六孔板取一个对照组，另外3个孔分别加不同浓度槐耳，作用24 h后用不含EDTA的胰酶消化细胞，轻吹使细胞分散，1500 r·min-1离心10 min弃上清，PBS重悬用300目筛网过筛，同样方法离心弃上清，用PBS清洗离心1~2遍后弃上清，每组加入500 μL缓冲液：100 μL 5×Binding Buffer和400 μL超纯水混匀后，每组各加10 μL PI染液和5 μL Annexin V混匀，室温避光孵育5～10 min，上机检测。

1.2.4 RT-qPCR实验 实验共分4组，对照组不加药和实验组加不同浓度槐耳。细胞加药培养48 h后提取总RNA，测A260值计算RNA浓度，反转录得到的cDNA及原RNA样本作好标记放于-80 ℃保存，实时定量PCR程序为：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性15 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共42个循环；随后72℃延伸10 min，4 ℃终止反应。实验使用GAPDH作为参照，实验中所用引物序列如下：P85α 正向引物（5'-ACTGAAGCAGATGTTGAACAAC-3'），P85α 反向引物（5'-CATCGATCATTTCCAAGTCCAC-3'），GAPDH 正向引物（5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'），GAPDH 反向引物（5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'）。实验结果用2-△△Ct法分析。

图1 细胞增殖实验检测槐耳对HCT8和HT29的细胞存活率的影响

图2 流式细胞术检测槐耳对HCT8和HT29细胞凋亡的影响

图3 槐耳对P85α mRNA的表达水平影响

图4 槐耳对不同基因表达影响

1.2.5 Western blot法检测蛋白表达 各组加药同上，细胞均放于培养箱培养48 h后取出提取各组蛋白。以每泳道40 μg蛋白质在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析蛋白质，200 mA 2h湿转至甲醇激活的PVDF膜（密理博）上，5% BCA封闭2 h后一抗孵育4 ℃过夜。TBST摇床洗涤5 min×4次，相应二抗室温孵育1 h，TBST洗涤5 min×4次。免疫复合物用显影仪Image Lab显影，Image J分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 槐耳对结直肠癌细胞有抑制增殖的作用

通过CCK8实验我们测得，当槐耳浓度为9、12、15、18、21 mg/mL时，HCT8细胞24 h存活率分别为：0.997±0.005、0.847±0.031、0.450±0.016、0.385±0.011、0.267±0.012；48 h存活率分别为：0.795±0.045、0.446±0.021、0.289±0.009、0.163±0.009、0.125±0.007。当槐耳浓度为6、9、12、15、18 mg/mL时，HT29细胞24 h存活率分别为：0.948±0.065、0.429±0.015、0.208±0.009、0.106±0.007、0.106±0.007、0.065±0.005；48 h存活率分别为：0.937±0.039、0.317±0.018、0.141±0.009、0.048±0.004、0.057±0.004。结果可看出，经过不同浓度槐耳处理后，HCT8和HT29细胞存活率显著降低（P均<0.05），且存活率随浓度递增而递减；同一浓度处理24 h的细胞存活率明显高于48 h，即存活率随药物作用时间延长而递减（**P<0.01，***P<0.001）。实验证明，槐耳对结直肠癌细胞HCT8和HT29具有降低存活力和抑制增殖的能力，且其抑制力随浓度和时间递增（图1）。

2.2 槐耳对结直肠癌细胞的促凋亡作用

不同浓度槐耳作用下，H C T8细胞凋亡率分别为：0.046±0.009、0.129±0.003、0.274±0.003、0.333±0.001，P均<0.001。HT29细胞中凋亡率分别为：0.03±0.010、0.160±0.003、0.213±0.001、0.250±0.006，P均<0.001。结果表明，槐耳能促进结直肠癌细胞HCT8和HT29的凋亡，且其凋亡率随浓度增加而递增（图2）。

2.3 槐耳调控PI3K/AKT信号通路

RT-qPCR实验结果表明，槐耳能降低HCT8和HT29细胞P85α mRNA的表达水平，如图3。不同浓度槐耳作用下HCT8的P85α mRNA的表达水平为0.105±0.027、0.085±0.029、0.081±0.035，P均<0.001；HT29的P85α mRNA的表达水平为0.429±0.011、0.290±0.008、0.245±0.016，P均<0.001。实验组细胞P85α mRNA的表达水平均显著低于对照组，可见槐耳能抑制P85α基因表达水平，从而抑制PI3K/AKT信号通路激活，且其表达水平随浓度增加而降低。

2.4 槐耳通过抑制PI3K/AKT信号通路促进结直肠癌细胞凋亡

为了进一步研究槐耳槐耳促进结直肠癌细胞的凋亡机制，我们通过western blot实验检测了槐耳作用后结直肠癌细胞内PI3K/AKT信号通路关键蛋白，凋亡蛋白及增殖蛋白。实验得出，加入槐耳后HCT8和HT29细胞中P85α、CyclinD1、CDK4的表达明显降低，p-AKT/AKT的比值明显降低，而BAX/BCL-2、Cleaved caspase-3/Caspase-3、Cleaved caspase-9/Caspase-9的比值显著升高（图4），P均<0.05。因此我们得知槐耳能抑制PI3K/AKT通路激活，下调CyclinD1、CDK4的表达，上调BAX、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的活化水平，减少细胞增殖和促进其凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT通路激活有关。

3 讨论

结直肠癌好发于中老年人，其死亡率位于全球第二，在发展中国家的发病率和死亡率正逐年提高，尤其在我国发病人群正逐步趋向年轻化[16]。临床上被发现时常常已是中晚期，治疗尤其困难，化疗药物产生的毒副作用更是让患者难以忍受，开发有效且毒副作用低的药物迫在眉睫。中药是我国不可忽视的瑰宝，在我国使用历史悠久。槐耳的抗癌作用早已引起众多学者的关注，其作为肿瘤的辅助用药具有很大的治疗潜力[10,11]。因此，本研究主要针对槐耳对结直肠癌细胞的促凋亡机制，为进一步探讨槐耳的药用价值做出一点贡献。

PI3K/AKT的异常激活使p-AKT活化水平提高，研究表明，过度激活的p-AKT与70%结直肠癌患者的细胞分裂和凋亡有关[17]。PI3Ks主要被分为三个类别，其中与癌症相关主要是ⅠA类，Ⅰ类PI3Ks是异二聚体，包含P85调节亚单位和P110催化亚单位[18]。活化的PI3K被募集到细胞膜上激活AKT，AKT活化后成为p-AKT调节增殖蛋白CDK、CyclinD等，和凋亡蛋白BAX、BCL-2，启动Caspase凋亡级联反应，从而调控肿瘤细胞的增殖和凋亡[14]。为了研究槐耳是否能抑制结直肠癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，我们选用了两株结直肠癌细胞HCT8和HT29进行实验。研究表明，槐耳能抑制HCT8和HT29细胞增殖和诱导凋亡。槐耳能显著降低增殖蛋白CyclinD1、CDK4的表达，从而抑制细胞增殖；显著提高BAX/BCL-2表达水平和上调Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的活化水平，从而诱导细胞凋亡；明显抑制HCT8和HT29细胞P85α mRNA的表达水平，显著降低PI3K的调节亚基P85α的表达量，下调P85α和p-AKT/AKT蛋白表达水平，抑制PI3K/AKT信号通路的激活。因此，槐耳能抑制结直肠癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路激活有关，这为我们研究结直肠癌的治疗方法提供了新的思路。然而，槐耳提取物中含多种成分，我们尚未研究清楚各组分之间的关联性及相互作用机制，仍需更多更深入的研究来明确其效果。

综上，槐耳能抑制HCT8和HT29细胞增殖和诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路激活有关。