骨肉瘤组织PBX1表达及其对患者预后的影响

白 伟 王 斌 郭甲瑞 朱光谱 朱丽艳

（1.焦作市第二人民医院骨科，河南 焦作 454000；2.郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南 郑州 450001）

骨肉瘤是骨科常见的恶性肿瘤，好发于儿童和青少年，发病率约为3/100万，患者预后差，病死率高[1]。虽然近年来临床诊疗技术有了长足的进步，延长了骨肉瘤患者的生存时间，但发生转移的骨肉瘤患者5年总体生存率依然较低，侵袭和转移仍然是导致患者死亡的主要因素[2]。有研究结果显示，转录因子异常表达与多种恶性肿瘤的发生、转移、浸润等过程密切相关[3]。前B淋巴细胞白血病转录因子（pre-B-cell leukemia transcription factor 1，PBX1）是同源盒基因家族成员之一，可通过发挥核转录因子功能参与胚胎发育和组织分化过程[4]，同时还参与了骨形成过程[5]。近年来的研究发现，PBX1还可发挥癌基因功能，参与了乳腺癌[6]、前列腺癌[7]等多种恶性肿瘤的发生、发展。为此，本研究拟探讨骨肉瘤组织PBX1基因和蛋白表达与临床病理参数的相关性和对患者预后的影响。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2013年1月-2016年1月焦作市第二人民医院行手术治疗的骨肉瘤患者85例，其中男49例、女36例，年龄（22.16±8.25）岁，术前均未行放、化疗治疗，术后经病理学检查确诊。其中，股骨、胫骨肿瘤患者52例，其他部位肿瘤患者33例；成骨细胞型41例，成纤维细胞型17例，成软骨细胞型16例，混合型11例；Enneking分期Ⅰ～ⅡA期36例，ⅡB～Ⅲ期49例；发生远隔转移42例。本研究经焦作市第二人民医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 样本收集和临床资料收集

术中留取骨肉瘤组织和距肿瘤边缘＞5 cm的正常骨组织，一部分组织样本用甲醛固定，石蜡包埋保存，另一部分于液氮中速冻，-70 ℃保存备用。收集所有患者的临床资料，包括性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、肿瘤大小、Enneking分期、是否有远隔转移。

1.2.2 免疫组化法检测组织中PBX1蛋白表达

取石蜡包埋样本，连续切片、烤片、脱蜡、抗原修复，采用3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，滴加10%山羊血清，37 ℃封闭15 min。滴加一抗兔抗人PBX1抗体（美国Abcam公司，1∶800稀释），4 ℃过夜孵育，磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）冲洗3次，加入生物素标记的二抗，37 ℃反应20 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB；上海研谨生物科技有限公司）显色，苏木素（美国Sigma公司）复染，梯度乙醇脱水，透明、封片，用PBS替代一抗作为阴性对照。显微镜下观察，随机取5个高倍视野进行观察。PBX1蛋白主要表达于细胞核中，少量存在于细胞质。根据阳性细胞比例和染色强度进行评分[8]。阳性细胞比例：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。染色强度：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。最终得分为二者的乘积，0分为阴性，≥1分为阳性。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测组织PBX1 mRNA表达

取骨肉瘤组织和正常骨组织，剪碎，加入细胞裂解液，采用总RNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取总RNA，采用NanoDrop One分光光度计（北京龙跃生物科技发展有限公司）检测其纯度和浓度，以A260nm/A280nm＞1.80为合格。使用逆转录试剂盒（上海索宝生物科技有限公司）将总RNA逆转录为cDNA。采用LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）和Realtime PCR定量试剂盒（上海索宝生物科技有限公司）进行PCR扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PBX1上游引物为5'-GAGACGGAATTTCAACAAGCA-3'，下游引物为5'-GTTTGATACCTGGGAGACTG-3'；内参基因GAPDH上游引物为5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，下游引物为5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'。反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，76 ℃30 s，38个循环。用2-ΔΔCt法计算PBX1 mRNA相对表达量。

1.2.4 随访

从术后第1天开始对所有患者进行随访，包括住院期间的查房和出院后的门诊复查、电话随访和病历追踪。随访时间为5年，随访终点事件为患者死亡，记录患者总生存时间和5年生存率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rankχ2检验分析骨肉瘤患者的生存情况。采用Cox比例风险回归分析评估影响患者预后的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织和正常骨组织PBX1蛋白表达

骨肉瘤组织PBX1蛋白阳性比较率为74.12%（63/85），显著高于正常骨组织[23.53%（20/85）]（χ2=43.530，P＜0.001）。见图1。

图1 骨肉瘤组织和正常骨组织PBX1蛋白表达（×200）

2.2 骨肉瘤组织和正常骨组织PBX1 mRNA相对表达量比较

骨肉瘤组织PBX1 mRNA相对表达量为2.61±0.24，高于正常骨组织（1.00±0.10）（t=58.044，P＜0.001）。

2.3 不同临床病理特征骨肉瘤患者肿瘤组织PBX1表达差异

Enneking分期ⅡB～Ⅲ期和发生远隔转移的骨肉瘤患者肿瘤组织PBX1蛋白阳性率和mRNA相对表达量分别高于Enneking分期Ⅰ～ⅡA期和无远隔转移的骨肉瘤患者（P＜0.05）。不同性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型和肿瘤大小的骨肉瘤患者肿瘤组织中PBX1蛋白阳性率和mRNA相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征骨肉瘤患者肿瘤组织PBX1表达比较

2.4 骨肉瘤患者生存情况分析

85例骨肉瘤患者均完成随访，随访时间为5～60个月，中位随访时间为28个月。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，PBX1蛋白阳性患者生存时间为（29.44±2.06）个月，5年生存率为17.46%，均低于PBX1蛋白阴性患者[（48.86±3.48）个月，63.64%]（Log-rankχ2=15.092，P＜0.001）。见图2。

图2 PBX1蛋白阳性组和阴性组生存情况分析

2.5 影响骨肉瘤患者生存期的危险因素分析

Cox比例风险回归分析结果显示，Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、发生远隔转移和PBX1蛋白阳性是影响骨肉瘤患者生存期的危险因素[风险比（hazard ratio，HR）分别为2.861、2.244和2.361，95%可信区间（confidence interval，CI）分别为1.204～6.799、1.047～4.814和1.258～5.265]。见表2。

表2 影响骨肉瘤患者生存期的危险因素分析

3 讨论

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性程度较高的肿瘤，侵袭性强，易早期发生转移。PBX1是一种同源盒基因家族成员，可作为转录因子参与机体的发育过程、干细胞编码和干性维持。有研究发现，多种恶性肿瘤组织PBX1表达异常[8-9]。LIU等[10]发现，抑制PBX1表达可诱导前列腺癌细胞凋亡。LIN等[11]发现，在急性白血病中，PBX1同源域通过t（1；19）染色体异位转化为嵌合E2A-PBX1癌蛋白拥有致癌活性。下调PBX1可能通过PBX1/信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，增加食管鳞状细胞癌细胞的放射敏感性[12]。本研究结果显示，骨肉瘤组织PBX1蛋白阳性率和mRNA相对表达量均高于正常骨组织（P＜0.001），说明骨肉瘤组织PBX1蛋白和基因均呈高表达，PBX1可能作为癌基因参与了骨肉瘤的发生。本研究结果显示，Enneking分期ⅡB～Ⅲ期和发生远隔转移的骨肉瘤患者肿瘤组织PBX1蛋白阳性率和mRNA相对表达量均显著升高，进一步说明PBX1可能参与了骨肉瘤的发展。

本研究结果还显示，PBX1蛋白阳性骨肉瘤患者生存时间和5年生存率均低于PBX1蛋白阴性患者（P＜0.001），提示PBX1蛋白与骨肉瘤患者预后密切相关。本研究Cox比例风险回归分析结果显示，Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、发生远隔转移和PBX1蛋白阳性表达是影响骨肉瘤患者生存期的危险因素。PBX1蛋白或可作为骨肉瘤预后评估的潜在生物标志物。

综上所述，骨肉瘤组织PBX1蛋白阳性表达率和mRNA表达量显著升高，且与Enneking分期和远隔转移有关，或可作为骨肉瘤患者早期诊疗和预后评估潜在的生物标志物，其具体作用机制还有待进一步研究。