快速眼动睡眠行为障碍和帕金森病患者血浆外泌体α-syn的变化

张新雨， 张婷婷， 许鹏飞， 王梦云， 王升辉， 周 瑶， 白莹莹， 张红菊

快动眼睡眠行为障碍（rapid eye movement sleep behaviour disorder，RBD）是一种异态睡眠，表现为快速眼动睡眠期出现与梦境相关的异常行为［1］；分为特发性RBD（idiopathic RBD， iRBD）和继发性RBD。约有30%～50%的PD患者伴有RBD［2］，因此又称 iRBD是帕金森病（Parkinson disease， PD）的临床前期。iRBD 转化为PD 间隔约5～10年［3］， 预测iRBD 转化的早期诊断可为PD的干预提供广阔的窗口。

PD 的病理改变是黑质细胞出现α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）的沉积和路易小体的形成，当黑质细胞损害达到50%～60%时才出现运动损害症状，因此iRBD 期间可能存在α-syn 的沉积。尸检研究证明iRBD 和PD 患者的胃肠道、涎腺和皮肤活检样本均存在α-syn［4-6］，部分iRBD 患者嗅黏膜［7］及肠黏膜［8］活检也发现了α-syn。

外泌体（exosome，EXO）是一种特殊的细胞外囊泡，通过胞体内陷与质膜融合释放。通过转运蛋白质、脂质、DNA、mRNA 和miRNA 等物质调节受体细胞的功能，参与细胞间交流、抗原提呈、病原体传播、免疫应答、程序性细胞死亡、血管生成、炎症反应和凝血等过程；可穿透血脑屏障传递中枢与外周信息。可在血清/血浆、脑脊液、尿液中均检到，对疾病早期诊断更加敏感和特异。越来越多的研究发现PD 血浆神经元外泌体中α-syn 较正常健康人升高［9］，而iRBD血浆外泌体α-syn研究报道结果不一。

本研究拟通过定量比较iRBD、早期不伴RBD的PD 患者（PD-nRBD）血浆外泌体α-syn 水平，寻找iRBD 转化的早期生物学标志物；通过对比分析血浆外泌体α-syn水平与iRBD夜间运动症状及PD-nRBD运动损害的评分相关性，探讨iRBD 的REM 睡眠异常行为的病理机制。

1 对象与方法

1.1 对象 从河南省人民医院神经内科招募符合欧洲运动障碍协会（MDS）PD 标准但不伴RBD的受试者21例为PD-nRBD 组，符合睡眠障碍国际分类第3 版iRBD 诊断标准的受试者20 例外为iRBD组，选取年龄、性别匹配的门诊健康体检者20 例为健康对照组（healthy control，HC）。

排除标准：（1）排除脑血管病、脑炎、癫痫、外伤等引起脑部结构功能改变的疾病；（2）排除家族性帕金森综合征、帕金森叠加综合征、药物导致的帕金森综合征、特发性震颤患者；（3）剔除重度心肺肝肾疾病及恶性肿瘤可能；（4）排除合并其他睡眠障碍患者；（5）排除药物、酒精依赖的人群；（6）排除焦虑、抑郁等精神疾病患者；（7）排除文盲、失聪等不配合者。iRBD 组需排除继发性RBD 患者；PD-nRBD组需排除伴RBD 的PD 患者，即快眼动睡眠障碍量表-香港版（RBDQ-HK）评分＞18排除。

1.2 临床量表评估 对所有受试者进行行为学评估，利用统一帕金森病评定量表第3 部分（The unified Parkinson disease rating scale，UPDRS Ⅲ）和Hoehn-Yahr（H-Y）分期量表评估运动损害症状，使用RBDQ-HK评估夜间梦境及异常行为。

1.3 血浆样本采集及外泌体提取 在取得受试者知情同意的情况下从每位受试者采集约10 ml血液，然后在4 °C 下静置6 h，并以3 000 g 离心15 min收集血浆，并储存于-80 °C冰箱待使用。

利用ExoQuickTM外泌体提取试剂盒（SBI，Cat EXOQ5A-1，Palo Alto，CA，USA）提取外泌体，通过透射电子显微镜证实分离的外泌体的形态；同时进行Western blotting 评估外泌体标志物（CD63、TSG101）的表达。

1.4α-syn 定量分析 为了量化和比较血浆外泌体α-syn 含量，我们使用ELISA 试剂盒（Elabscience Biotechnology，E-EL-H0983c，Wuhan，China）进行测量。

1.5 统计分析 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料采用（±s）表示，方差齐性的多组比较采用单因素方差分析，两独立样本比较采用t检验；非正态分布的计量资料以中位数和（四分位数）［M（P25，P75）］表示，组内比较采用秩和检验，组间比较采用U检验；计数资料以相对数构成比（%）或率（%）表示，采用Fisher 确切概率分析；符合正态分布的数据采用Pearson 相关分析，不符合正态分布的数据采用Spearman 相关分析。P＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 人口信息学资料及临床量表评估结果

研究期间共纳入61 例受试者，其中iRBD 组20 例，平均年龄（63.05±6.94）岁，男性12 例；PD-nRBD 组21例，平均年龄（62.24±6.09）岁，男性12例；HC组20例，平均年龄（61.7±6.88）岁，其中男性12例（见表1）。

表1 iRBD、PD-nRBD、HC组人口信息资料及临床量表评分比较

iRBD、PD-nRBD、HC 组在年龄、性别、受教育程度、BMI 上不具有统计学意义（P＞0.05），iRBD 组和PD-nRBD 组病程不具有统计学差异（P＞0.05）（见表1）。

iRBD、PD-nRBD、HC组RBDQ-HK评分具有统计学差异（P=0.000 1），其中iRBD 组评分分别高于PDnRBD、HC 组（P=0.000 1，0.000 1），PD-nRBD 与HC组不具有统计学差异（P＞0.05）。3组UPDRS III评分具有统计学差异（P=0.000 1），其中iRBD、PD-nRBD组评分分别高于HC组（P=0.045，0.000 1），PD-nRBD组评分明显高于iRBD组（P=0.000 1）（见表1）。

2.2 血浆外泌体的鉴定

2.2.1 透射电镜检测血浆中提取的外泌体形态学 取出冻存于-80 ℃冰箱中的外泌体重悬液，置于透射电镜下检测，观察iRBD组（见图1A）、PD-nRBD组（见图1B）、HC组（见图1C）均可见多个大小均一的囊泡状结构，直径为30～150 nm，与其他文献报道结果一致［10］，经上述鉴定证实提取的囊泡结构为外泌体颗粒。

图1 血浆外泌体的鉴定

2.2.2 血浆外泌体内源性特异性蛋白检测

根据蛋白组学，外泌体可表达特定的蛋白分子，称之为内源性特异性蛋白，如CD9、CD63、TSG101等［11］。利用Western blotting 检测CD63、TSG101 表达情况，结果显示3 组提取物均有大量CD63、TSG101 表达（见图1D），说明提取物中含有大量外泌体颗粒。

2.3 血浆及血浆外泌体α-syn 的比较 使用ELISA 法检测血浆外泌体中α-syn 的含量，结果显示3 组血浆外泌体α-syn 存在差异（P=0.001），iRBD 组和PD-nRBD 组血浆外泌体α-syn分别高于HC 组（P=0.010，P=0.007），PD-nRBD 组与iRBD 组间无明显差异（P＞0.05）（见图2）。

图2 ELISA法检测血浆及血浆外泌体中α-syn含量

2.4 iRBD、PD-nRBD 组血浆外泌体α-syn 与临床量表评分的相关性分析 见表2，结果显示：iRBD组血浆外泌体α-syn 与RBDQ-HK 呈正相关（r=0.842，P=0.000 1）（见图3A）；PD-nRBD 组血浆外泌体α-syn 水平分别与UPDRS Ⅲ评分和H-Y 分期正相关（r=0.817，P=0.000 1；r=0.592，P=0.005）（见图3B，3C）。

图3 血浆外泌体α-syn与PD-nRBD、iRBD临床资料的相关性分析

表2 血浆外泌体α-syn与PD-nRBD、iRBD临床资料的相关性分析

3 讨 论

iRBD是指患者在快速眼动睡眠期出现与梦境相关的异常行为［1］；多导睡眠监测显示患者在REM睡眠期出现失张力障碍［12］。纵向研究发现90%以上的iRBD历经10年后发展成了α-突触核蛋白病［13］，PD是α-突触核蛋白病中发病率最高的神经变性病之一，RBD 是PD 的非运动症状［14］，又被称为PD 的临床前期，寻找iRBD转化的早期生物学指标可为PD的干预提供广阔的窗口。外泌体是中枢与外周对话的重要信使，可携带大量的中枢信息穿过血脑屏障；研究证明部分血浆外泌体α-syn来源于中枢神经系统［9］，并发现PD血浆神经元外泌体增加［10，15］，α-syn通过外泌体传递是PD发病机制的重要环节［16］。因此推测未来转化的iRBD血浆外泌体也存在α-syn聚集。

我们的行为学结果显示：iRBD 患者夜间梦境及异常，明显高于PD-nRBD 患者和正常人群，3 组UPDRS Ⅲ评分具有统计学差异，且存在组间差异，其中PD-nRBD 评分最高，HC 评分最低。说明iRBD组夜间运动症状最显著，而日间运动损害较PDnRBD低。

iRBD、PD-nRBD 组血浆外泌体α-syn 分别较HC组升高。既往研究发现PD 血浆外泌体α-syn 较HC升高［17-21］，与我们的研究结果一致。另一项研究报告PD 血浆神经元外泌体α-syn 降低，并认为外泌体在中枢神经系统中发挥保护/危害双重作用，黑质纹状体的星形胶质细胞分泌的外泌体对PD 具有神经保护作用［22，23］，外泌体也具有触发、加速靶细胞α-syn寡聚［24，25］，而加剧细胞的损害。

有关iRBD 外泌体α-syn的报道较少，结果不一。Zhao等人［26］的研究报告与我们的结果一致，即iRBD血浆外泌体中α-syn较HC组升高；也有不同的报告：iRBD 与HC 的血浆外泌体α-syn水平无差异［15］，但血浆神经元外泌体α-syn 升高［10，15］。我们的结果未发现iRBD 与PD-nRBD 患者血浆外泌体α-syn 存在差异，但有研究发现PD 血浆外泌体α-syn 较iRBD 组升高［27］。这可能与受试者入选排除标准不同以及病程不同有关。我们的结果提示iRBD 患者血浆外泌体存在α-syn，说明了iRBD 存在α-syn 的病理损害；其含量较PD-nRBD 偏低，但无统计学差异，说明iRBD的α-syn 病理损害类似于PD-nRBD，也提供了iRBD是PD临床前期的病理证据。

我们的相关分析显示：PD-nRBD 血浆外泌体α-syn 与UPDRS Ⅲ评分和H-Y 分期正相关，进一步说明了血浆外泌体α-syn 的含量与疾病的运动损害程度显著相关［9，15，28，29］；一项纵向研究表明晚期PD患者较早期PD 患者血浆外泌体α-syn 增高［15］，说明了PD 越严重α-syn 越多。iRBD 特征性表现是夜间REM 睡眠期与梦境相关的异常行为，RBDQ-HK 可主观评估iRBD 患者夜间梦境及异常运动情况，我们的结果显示：iRBD 的血浆泌体α-syn 的含量与RBDQ-HK 正相关，说明α-syn 越多梦境相关的异常行为越严重。Yan 等人［27］发现iRBD 患者血浆神经元外泌体α-syn与病程相关，梦境相关的异常行为随病程的延长而更加明显，间接支持了我们的相关结果。进一步说明iRBD 梦境相关的异常行为的病理生理机制与α-syn沉积有关。

综上所述，血浆外泌体α-syn 有望成为iRBD 转化的早期生物标记物，也可作为PD、iRBD 疾病监测的评价指标，同时可作为评估疾病运动损害的重要标志。我们的研究仍存在一些局限性，首先我们的样本量较小；其次，RBD 是通过RBDQ-HK 进行的主观评估，可能会影响入组患者的精准性；未来我们将继续扩大样本量并进行纵向研究，同时利用多导睡眠监测对RBD 进行的精准筛选，进一步探索血浆外泌体α-syn水平在iRBD向PD转化过程中作用。

伦理学声明：本研究获得河南省人民医院医学伦理委员会（201715）批准。所有参与者或其监护人均签署知情同意书。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：张新雨负责撰写论文、研究过程的实施、统计学分析、绘制图表、文献收集、论文修改、拟定写作思路；张婷婷、许鹏飞、王升辉、周瑶、白莹莹负责数据收集、实验操作；张红菊负责指导撰写文章并最后定稿。