复合富硒植物固体饮料的制备及其生物活性研究

郑贵娟，罗建群，南占东，杨 敏，何美军,4,*，姚广民,2,*

（1.华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉 430030；2.恩施硒禾生物科技有限公司，湖北恩施 445000；3.恩施硒司令生态农业科技发展有限公司，湖北恩施 445000；4.湖北省农业科学院中药材研究所，湖北恩施 445000）

硒（Selenium，Se）是一种稀散的元素[1]，在自然界中的含量及其稀少。世界卫生组织和国内营养组织认定硒是人体必需的微量元素之一[2]，缺硒会严重影响人体健康，如克山病、大骨节病、免疫缺陷和甲状腺疾病等[3-5]。硒元素在自然界中存在有机硒和无机硒两种方式，其中有机硒包括硒蛋白、硒代氨基酸及硒多糖等，它们容易被人体吸收，但其物质成本高且成分复杂[6]。人体硒的主要来源是通过食物摄入，其中富硒农作物是人体获取有机硒的重要途径之一[7-8]。恩施州，誉有“世界硒都，中国硒谷”的美称，拥有不可替代的世界级硒资源，具有发展天然富硒特色农业和硒精深加工产业的顶级资源优势[9]。

西兰花富含抗坏血酸、硫代葡萄糖苷等活性成分[10]，聚硒能力强[11]，具有抗衰老、防癌抗癌、增强机体免疫力等作用。葛根富含葛根素及异黄酮类物质，具有抗氧化、解酒护肝、预防骨质疏松等功效[12]。藤茶中富含多酚类物质以及儿茶素的氧化聚合成分，具有抗炎、降血压、降血脂等作用[13-14]。黄精富含甾体皂苷、黄精多糖和黄精低聚糖，能补气养阴，健脾润肺，具有增强免疫功能、抗衰老、耐缺氧、抗疲劳等作用。木瓜性温味酸，平肝和胃，具有抗氧化、增强人体免疫力等作用。西红柿富含胡萝卜素和番茄红素，对抗衰老、预防癌症、降低心血管疾病等具有积极作用[15]。恩施地区丰富的药食同源植物因富含硒元素而具有更高的营养价值[16]，是发展有机硒产业的资源宝库。

近年来，随着生活水平的提高，人们医疗消费观念也从治已病转向“预防和保健”[17]。保健饮料越来越受到消费者青睐，具有广阔的市场需求和发展前景。目前市售富硒固体饮料包括富硒葛桑饮、富硒黑木耳固体饮料、富硒姬松茸固体饮料、富硒麦芽粉固体饮料、富硒蛋白粉固体饮料等，配制原料通常为一种或两种，配伍简单，成分相对单一，且未见相关功能性研究的报道。本研究以药食同源植物材料富硒西兰花、葛根、藤茶、黄精、木瓜和西红柿等六种原料合理配伍，开发一款复合富硒植物功能性固体饮料，营养成分丰富。本研究对其开展多种功能活性评价，包括抗肿瘤细胞增殖活性、抗氧化活性和镇痛活性等，并首次报道对该类固体饮料的抗肿瘤活性和镇痛活性研究。该富硒固体饮料的开发对于预防疾病、强身保健具有重要现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富硒西兰花、葛根、藤茶、黄精、木瓜、西红柿等新鲜材料 恩施硒禾生物科技有限公司；硒标准溶液（1000 µg/mL） 国家有色金属及电子材料分析检测中心；3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-tetrazolium（MTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFHDA）、顺铂（DDP）、紫杉醇（Taxol）和维生素C 等Sigma 试剂公司；Biosharp 胎牛血清、DMEM 细胞培养液、RMPI-1640 细胞培养液、PBS 缓冲盐溶液、细胞裂解液、H2O2、DMSO、HNO3、生理盐水和琼脂培养基等 迪米特（武汉）生物试剂有限公司；无水乙醇、冰醋酸 分析纯，国药集团有限公司；大肠杆菌CICC10389、沙门氏菌CICC21513、志贺氏菌CICC21680 和金黄色葡萄球菌CICC21600 等微生物标准菌液 中国工业微生物菌种保藏管理中心；肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞SW480、人肺上皮细胞BEAS-2B、人肝癌LO2 细胞等细胞 实验室自存细胞株；昆明KM 小鼠 80 只，雌雄各半，体重约18～22 g，华中科技大学同济医学院实验动物中心，实验动物使用许可证号SCXK（湖北）2021-0057，生产许可证号SCXK（湖北）2020-0018。

DHG-9240A 鼓风干燥箱 上海超鸿仪器设备有限公司；PSD 型离心机 张家港市恒安机械制造有限公司；HZ-TNG 多功能提取浓缩机组 上海辉展实验设备有限公司；XDW-6 系列超微粉碎机 济南达微机械有限公司；GMS 红外干燥灭菌烘箱 常州市龙杰干燥机械有限公司；AFS-820 原子荧光光度计 北京吉天仪器有限公司；TE2000-S 荧光倒置显微镜 日本尼康公司；Bio-Rad680 多功能酶标仪北京东迅天地医疗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复合富硒植物固体饮料的研制 操作要点：

a.分选、去杂和漂洗：选取基地种植的富硒西兰花、葛根、藤茶、黄精、木瓜和西红柿等原料，其中干燥后的植物原料中硒含量均不低于150 µg/kg[18]。将泥土、杂质去除，原材料清洗干净、沥水。

b.预处理：根据物料特性将原料剪切和破碎等均匀处理。

c.干燥：将剪切后的西兰花、黄精、藤茶、葛根、木瓜和西红柿用鼓风干燥箱进行干燥，温度不高于60 ℃，烘干后含水率3%～8%。

d.加热浸提：按干燥后重量将西兰花、葛根、藤茶、黄精、木瓜、西红柿按照3:4:2:2:2:2 配伍，加入蒸馏水在60 ℃浸提2 h，料液比为10:1。

e.过滤、脱色：用100 目网筛的滤袋装离心机过滤，除去废渣、颗粒性物质以及沉淀的淀粉等，得到滤液I。将滤液I 用活性碳柱进行脱色处理，得到滤液II。

f.浓缩：将滤液II 真空浓缩，温度60 ℃，真空度-0.06 Mpa，浓缩至相对密度为1.08～1.22，放置室温无菌状态下冷却，得到提取物干膏。

g.干膏粉碎：将提取物干膏粉碎，过100 目筛，得到固体粉末，即为富硒固体复合固体饮料。

h.检验：对产品感官品质、微生物限度以及硒含量等进行检验。

1.2.2 复合富硒植物固体饮料感官评价指标测定称取5 g 样品于洁净玻璃杯中，在室温、自然光环境下用肉眼观察其色泽和外观形态。称取一定量样品按照比例在无色玻璃杯中冲溶稀释后，立即嗅其香气，辨其滋味，静置2 min 后，观察烧杯底部有无沉淀。选择10 名有经验的专业人员（男6 名，女4 名），年龄在20～35 之间的成员组成的品评小组，分别从色泽（25 分）、滋味（25 分）、香气（25 分）和组织形态（25 分）等方面综合评定复合富硒植物固体饮料的品质[14]，满分100 分。品评指标见下表1。

1.2.3 微生物指标测定 参考国家标准GB 4789.2-2016[19]、 GB 4789.3-2016[20]和 GB 4789.4-2016[21]测定复合富硒植物复合固体饮料中菌落总数、大肠杆菌数和致病菌数。取10 g 富硒复合固体饮料装入有100 mL 生理盐水的无菌均质袋中，制成1:10 的样品溶液；取1:10 的样品溶液1 mL，沿管壁缓慢注入装有9 mL 生理盐水的无菌试管中，注意吸管不要触碰稀释液面，振摇试管混合均匀，制成1:100 的样品溶液；取1:100 的样品溶液1 mL，沿管壁缓慢注入装有9 mL 生理盐水的无菌试管中，振摇试管混合均匀，制成1:1000 的样品溶液。根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计，分别吸取1 mL 的1:10、1:100、1:1000 的样品溶液于无菌平板中，每个浓度平行做3 个平板。同时，吸取1 mL 的空白稀释液加入3 个无菌平板中作为空白对照，吸取1 mL标准菌液加入3 个无菌平板中作为阳性对照。加入琼脂培养基，并混合均匀，在37 ℃下培养48 h，根据培养出的菌落数，计算活菌数。

1.2.4 复合富硒植物固体饮料硒含量的测定 采用荧光光度法测定复合富硒植物固体饮料中的硒含量[22]。使用体积分数为5% HNO3溶液，将硒标准储备液逐级稀释，配制系列浓度0、0.5、1、5、10、20、40 和80 µg/L，制备硒标准溶液。

称取复合富硒固体饮料粉末0.5 g 置于石英试管中，加入5% HNO3溶液10 mL，H2O2溶液5 mL，浸泡12 h，放入微波消解仪中消解10 min（功率1000 W，温度130 ℃）。冷却后超声脱气5 min，定容至25 mL，摇匀，待测定硒含量，平行测定3 次，同时做空白实验。

1.2.5 复合富硒植物固体饮料抑制肿瘤细胞增殖活性测定 采用MTS 法[23-26]评价该固体饮料对4 株肿瘤细胞（肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7 和结肠癌SW480）和1 株正常肺上皮细胞（BEAS-2B）的细胞增殖活性的影响。设定顺铂（DDP）和紫杉醇（Taxol）为2 组阳性对照，添加剂DMSO 为阴性对照。

用含10%胎牛血清的细胞培养液（DMEM 或RMPI-1640）配成单细胞悬液种于96 孔板（1×104个/孔），每孔体积100 μL，培养24 h 后加入待测定样品溶液。植物硒固体饮料的粉末用DMSO 溶解，以100 μg/mL 浓度初筛，每孔终体积为200 μL，每种处理均设3 个复孔。在细胞培养箱中37 ℃，5% CO2培养48 h 后，吸弃孔内培养液，每孔加20 μL MTS溶液和100 μL 培养液，继续孵育2～4 h。使用多功能酶标仪读取492 nm 波长下各孔光吸收值，记录结果，处理数据。

1.2.6 复合富硒植物固体饮料抗氧化活性测定

1.2.6.1 复合富硒植物固体饮料DPPH 自由基清除力的测定 精确称取复合富硒植物固体饮料的粉末样品，用无水乙醇配置成浓度梯度的溶液（50、100、200、500、1000 和2000 μg/mL），取100 μL 样品溶液，加入100 μL 0.2 mol/L DPPH 溶液、立即混匀，每种处理均设3 个复孔。室温避光放置30 min，使用多功能酶标仪读取517 nm 波长下各孔光吸收值[27-28]。设定维生素C 为阳性对照，无水乙醇为阴性对照组，按如下公式计算清除率。

式中：AS为DPPH 溶液加入样品后的吸光度值；Asb为样品本身的吸光度值（不加DPPH 溶液）；Ab为空白组吸光度值。

1.2.6.2 复合富硒植物固体饮料对H2O2诱导LO2细胞形态的影响 实验分组：空白对照组、H2O2造模组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）阳性药组和待测定样品组，每组均设定3 个复孔。设定复合固体饮料粉末浓度梯度为5、10、15、20、30 和50 μg/mL。

实验步骤参照文献[29]，取处于对数生长期且生长状态良好的LO2 细胞，消化计数后接种于24 孔板（4×104个/孔），每孔体积500 μL，培养24 h 后加入待测定样品。用培养基稀释样品储备液至待测定样品的浓度，每孔加入500 μL 样品，其中空白对照组、H2O2造模组只加入培养基，NAC 阳性对照组加入4 mmol/L NAC，继续培养24 h。吸弃孔内液体，用PBS 润洗两次，所有组加入H2O2（1 mmol/L）作用30 min。吸除H2O2，PBS 润洗两次，每孔加10 μmol/L DCFH-DA 染色30 min，室温下避光。每孔用PBS 润洗两次，吸除PBS 后在荧光显微镜下拍照（放大200 倍），观察各组LO2 细胞形态。

1.2.6.3 复合富硒植物固体饮料对H2O2诱导LO2细胞内活性氧的影响 利用DCFH-DA 荧光探针法[30-31]评价该固体饮料对H2O2诱导LO2 细胞内活性氧影响。

实验分组和细胞培养步骤同上述1.2.6.2，设定复合固体饮料粉末浓度梯度为5、10、15 和20 μg/mL。每组细胞加入H2O2诱导后，每孔加入400 μL 裂解液，室温下避光摇床孵育10 min，将24 孔板中的裂解液分别加至黑框透明底的96 孔板的3 个孔中（100 μL/孔）。采用荧光酶标仪检测细胞内活性氧荧光强度，激发光波长488 nm，发射光波长520 nm。

1.2.7 复合富硒植物固体饮料镇痛活性的测定 昆明KM 小鼠，体重约18～22 g，为避免由于性别差异造成的实验误差，小鼠雌雄各半分成八组，每组10只。动物实验经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会批准（批准文号2021-S748），实验人员严格遵守动物伦理准则。

设模型组（0.9% NaCl 溶液），阳性对照组（吗啡溶液5、1、0.2 和0.04 mg/kg）[32-35]和复合植物固体饮料的高中低三个剂量组（250、50 和10 mg/kg[36-37]，标记为A1、A2 和A3）。

小鼠在醋酸诱导疼痛模型下会表现出比较明显的扭体反应，而具有镇痛效果的活性成分则会减少扭体次数[32-35]。小鼠出现腹部内凹，躯干与后肢伸张，臀部高起等行为[37]，称为一次完整的扭体反应。实验前小鼠禁食不禁水12 h，各组小鼠称重。将每只小鼠单独放在铁网笼里独立观察，腹腔注射不同剂量的待测定样品溶液30 分钟后，腹腔注射0.8% V/V 的醋酸溶液（0.1 mL/10 g），记录每只小鼠30 min 内的扭体次数。

镇痛抑制率（%）= [（模型组扭体次数-给药组扭体次数）/模型组扭体次数]×100

1.3 数据处理

各组实验数据均以平均值±方差表示，采用统计软件GraphPad Prism 8.0 进行统计分析并绘图，两组数据间比较采用t检验法，*P＜0.05、**P＜0.01 和***P＜0.001 表示具有显著性差异，ns 表示无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 感官指标

分别从色泽、滋味、香气和组织等四方面综合评定复合富硒植物固体饮料的感官品质，四个评定项目的权重相同，综合品评小组10 人的打分，该样品感官指标得分均值为92.15 分。该复合富硒植物固体饮料溶解后呈浅黄色，色泽均一；口感好，酸甜可口，后味绵长；澄清透明，组织细腻；香气浓郁协调。

2.2 微生物指标

固体饮料中微生物指标的标准值为菌落总数≤30000 CFU/g，大肠杆菌≤900 MPN/kg，不得检出沙门氏、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌等致病菌。按照微生物检测方法测得该复合富硒植物固体饮料中的菌落数≤1000 CFU/g，大肠杆菌≤40 MPN/kg，且未检测出相关致病菌，符合国家标准要求（GB 4789.2-2016、GB 4789.3-2016 和GB 4789.4-2016）。

2.3 复合富硒植物固体饮料中硒含量测定

以质量浓度（µg/L）为横坐标，荧光强度值为纵坐标，绘制硒溶液标准曲线。硒含量在0～80 µg/L 范围内线性关系良好，相关系数为0.9999，回归方程为Y=112.50X-5.82（图1）。根据湖北省制定的《富有机硒食品硒含量要求》中规定食品中的总硒含量达到150 μg/kg（固体）或75 μg/L（液体），即可称“富含硒”或“富硒”食品。通过对复合富硒固体饮料的样品进行硒含量检测，其总硒含量为540±30.12 μg/kg，符合富硒要求。

图1 硒含量标准曲线Fig.1 Standard curve of selenium content

2.4 复合富硒植物固体饮料抑制肿瘤细胞增殖作用

以细胞抑制率为纵坐标，顺铂（DDP）和紫杉醇（Taxol）的浓度为横坐标，绘制细胞的存活率图（图2），应用Reed-Muench 公式计算阳性药的IC50值（表2），表明此研究模型成立。

图2 顺铂（DDP）和紫杉醇（Taxol）对肿瘤细胞和正常细胞的活力影响Fig.2 Effects of cis-platin and taxol on the viability of cancer cell and normal cell lines

结合植物硒固体饮料组数据可见（图3），复方富硒固体饮料在100 μg/mL 浓度下，能够促进人正常肺上皮细胞BEAS-2B 的增殖，增长率为12.56%±1.85%。同时，该复方富硒固体饮料能够一定程度的抑制肺癌细胞A-549，肝癌细胞SMMC-7721，乳腺癌细胞MCF-7 和结肠癌细胞SW480 的增殖，抑制率分别为4.09%±1.36%，19.48%±3.18%，30.75%±1.45%和18.20%±1.12%，说明该复合富硒固体饮料能一定程度的体外抑制癌细胞增殖且对正常细胞没有破坏作用。本研究结果表明该类复合固体饮料具有体外的抗肿瘤细胞增殖活性。

图3 复合富硒植物固体饮料对癌细胞和正常细胞的活力影响Fig.3 Effects of compound selenium-enriched plant solid beverage on the viability of cancer cell and normal cell lines

2.5 复合富硒植物固体饮料抗氧化作用

2.5.1 复合富硒植物固体饮料DPPH 自由基清除活性 由图4 可知，植物硒固体饮料在50 μg/mL 浓度下DPPH 自由基清除率为32.28%；在50～1000 μg/mL浓度范围时，DPPH 自由基清除率随着样品浓度的升高而升高；在1000～2000 μg/mL 间，DPPH 自由基清除率稳定在90%以上，其IC50为435.6±27.2 μg/mL。该实验结果表明该富硒复合固体饮料样品有一定的DPPH 自由基清除能力，并呈现一定的量效关系，说明该富硒复合固体饮料具有抗氧化作用。

图4 复合富硒植物固体饮料的DPPH 自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging ability of the compound selenium-enriched plant solid beverage

2.5.2 复合富硒植物固体饮料对H2O2诱导LO2 细胞形态影响 LO2 细胞用H2O2造模处理30 min，H2O2造模组的荧光强度明显强于空白对照组，说明LO2 细胞氧化损伤模型造模成功。图5 为复合富硒固体饮料对H2O2诱导的LO2 细胞形态图。植物硒固体饮料样品组的荧光强度均明显低于造模组，且与空白对照组和NAC 阳性药组的荧光强度接近，样品组各浓度之间荧光强度无明显差异，说明该复合富硒植物固体饮料具有显著的抗氧化活性。

图5 复合富硒植物固体饮料对H2O2 诱导的LO2细胞形态的影响Fig.5 Effects of the compound selenium-enriched plant solid beverage on morphology of H2O2-induced LO2 cells

2.5.3 复合富硒植物固体饮料对H2O2诱导LO2 细胞内活性氧的作用 DCFH-DA 在细胞内被水解为2',7'-二氯二氢荧光素（DCFH），DCFH 在细胞内与活性氧反应生成有荧光的2',7'-二氯荧光素（DCF），由此DCFH-DA 荧光强度可反映细胞内活性氧水平。如图6 所示，植物硒固体饮料实验组在5、10、15 和20 μg/mL 的浓度下，氧化损伤的LO2 细胞内荧光强度依次减弱，细胞内活性氧水平依次降低。该固体饮料能逆转H2O2诱导LO2 细胞内活性氧水平升高，具有抗氧化活性。植物硒固体饮料在20 μg/mL 浓度下，其抗氧化活性与阳性药N-乙酰半胱氨酸（NAC，4 mmol/L）活性相当。实验结果表明该复合富硒固体饮料具有明显的抗氧化活性。

图6 复合富硒植物固体饮料的活性氧荧光强度Fig.6 Active oxygen fluorescence intensity of the compound selenium-enriched plant solid beverage

2.6 复合富硒植物硒固体饮料镇痛作用的研究结果

小鼠在醋酸诱导疼痛模型下会表现出比较明显的扭体反应。统计各实验组数据，复合富硒固体饮料镇痛作用结果如图7 所示，在醋酸诱导的小鼠扭体实验中，与模型组相比较，该复合富硒固体饮料各剂量组（A1：250 mg/kg；A2：50 mg/kg；A3：10 mg/kg）均具有显著的镇痛作用（P＜0.01），其镇痛抑制率分别为92.3%、75.6%和67.5%。其中该复方固体饮料的高剂量组（250 mg/kg）的效果与阳性药组吗啡（5 mg/kg）的效果相当。本研究首次报道该类复合固体饮料的镇痛活性，研究结果表明该植物硒固体饮料具有显著的镇痛作用。

图7 复合富硒植物固体饮料在醋酸扭体模型中的镇痛作用Fig.7 Analgesic activities of the compound selenium-enriched plant solid beverage in the writhing model

3 结论

本研究以药食同源富硒西兰花、葛根、藤茶、黄精、木瓜和西红柿为原料，开发一款功能性的复合植物硒固体饮料，其总硒含量为540±30.12 μg/kg。该复合植物固体饮料不仅保留了植物原料的香气，无添加剂，食用安全，而且体积小，携带方便，符合现代人群的快节奏生活需求。本研究首次对固体饮料类产品的抗肿瘤活性和镇痛活性进行研究，结果表明此款复合植物硒固体饮料具有一定的体外抗肿瘤活性，在100 μg/mL 浓度下对四种肿瘤细胞株（A549、SMMC-7721、MCF-7 和SW480）的 抑 制 率 范 围4.09%～30.75%。该固体饮料在高剂量组（250 mg/kg）具有显著的镇痛作用（P＜0.001），其镇痛抑制率为92.3%，其镇痛效果与阳性药吗啡（5 mg/kg）的效果相当。因此，该复合植物硒固体饮料具有广阔的应用价值，本研究结果可为复合富硒植物固体饮料进一步开发奠定基础，为恩施地区药食同源植物资源的综合利用提供了理论依据。但本实验所得数据尚不充分，还需要更多不同的活性评价模型来开展深入研究，且该复合固体饮料的活性机制尚不明确，故对该复合固体饮料的认识还需更充分细致的研究。