香菇多糖通过IL-6/STAT3/Notch 信号通路调控胰腺癌细胞增殖、迁移及化疗敏感性

张 冬，邓同兴，王丰刚，林小博，程杰西，马永超

（漯河医学高等专科学校，河南漯河 462002）

胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）是最具侵袭性的消化系统致命癌症，预后严重，死亡率高，5 年生存率小于5%[1]。虽然胰腺癌的发病机制和病因尚未完全阐明，但一些常见的胰腺癌危险因素已被报道，包括吸烟、肥胖、遗传、糖尿病、饮食，甚至胰腺炎和饮酒。胰腺癌的治疗包括手术、放射治疗、化疗和姑息治疗[2]。然而，复杂的胰腺癌手术或联合治疗并不能取得良好的疗效，迫切需要更有效的治疗方法[3]。而食品来源的活性物质具有毒副作用小等特点，因此，研究香菇多糖对胰腺癌细胞增殖、迁移及化疗敏感性的影响及其机制，可以为胰腺癌的辅助治疗提供实验依据。

胰腺癌的发生不仅受到丝氨酸/苏氨酸激酶11（STK11）、蛋白酶、丝氨酸1/蛋白酶、丝氨酸2 （PRSS1/PRSS2）、Pim-1 等基因突变的高度影响，也受到炎症细胞、趋化因子和细胞因子为主的微环境的影响[4]。研究显示，白细胞介素-6（IL-6）与自身免疫性疾病、癌变等有关，并已证明其影响PC 的发生、进展、预后和转移[5]。研究显示，Notch 信号通路在癌症的进展、自我更新中起着重要作用，能调节肝癌细胞的增殖[6]，而且Notch 信号传导和IL-6 相互作用在肝细胞癌、乳腺癌中作用已经得到证实，能有效的调控癌症的进展[7-8]。而调节IL-6/STAT3 信号通路能有效调控药物对癌细胞的化学增敏作用[9]，包括IL-6 通过STAT3/Notch 信号通路调节多发性骨髓瘤细胞系对硼替佐米的耐药及化学敏感性[10]。

香菇多糖（Lentinan）是从香菇中分离出来的β-（1,3）-葡聚糖多糖，具有低毒和抗肿瘤、抗炎和免疫增强等多种活性，能通过增强宿主的免疫应答（特别是T 淋巴细胞介导的应答间接发挥抗）肿瘤作用[11]。与单纯化疗相比，香菇多糖联合化疗可显著延长结直肠癌患者的生存率，改善免疫反应，减少不良反应，表明香菇多糖对抗肿瘤作用具有一定的辅助作用[12]。已有研究显示，香菇多糖治疗胰腺癌具有一定的效果[13]，且胰腺癌组织中，IL-6/STAT3 信号通路和Notch 信号通路均处于激活状态[14-15]，而香菇多糖能否通过IL-6/STAT3/Notch 信号通路发挥抗癌作用并不明确。本研究重点分析香菇多糖对胰腺癌细胞增殖、迁移及化疗敏感性的影响，并分析其机制，为香菇多糖的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BALB/c 裸鼠 30 只SPF 级5～6 周龄，雄性，体重（16～20 g），购自中国科学院上海动物实验中心，动物合格证号SCXK（沪）2017-0005。标准动物房饲养，温度（22±5）℃ , 湿度（57±8）%，光暗交替各 12 h，自由获得标准的饲料和水；人胰腺癌Capan-1 细胞株 碧云天生物技术有限公司；干香菇 购自漯河市许慎市场；MTT 试剂盒、IL-6 北京索莱宝科技有限公司；兔抗p- STAT3、STAT3、Notch1、Hes1、Ki-67、MMP-9、MRP1、P-gp、HRP 标记的羊抗兔IgG二抗 美国Sigma 公司。

DMIL LED 倒置荧光显微镜 德国徕卡公司；ELx800 全自动酶标仪 美国BioTek 公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统 美国BIO-RAD 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香菇多糖的提取 准确称取500 g 香菇，粉碎后过40 目筛，料液比1:60（g:mL）加水混匀，70 ℃超声辅助提取2 h，提取2 次，过滤，减压至250 mL，D101 大孔树脂纯化，蒸馏水洗脱，浓缩至250 mL，加入终浓度为 80%乙醇，静置过夜，抽滤，溶解，二次醇沉，无水乙醇、丙酮冲洗，得香菇多糖。选择葡萄糖为标准品，苯酚-硫酸法检测多糖水平[16]。标准曲线方程为y=51.432x-0.0213（r=0.9998）。线性范围0.00287～0.01762 mg/mL，纯度为91.27%。溶于0.1%二甲基亚砜中，培养基稀释；动物实验进行时，采用PEG400 溶解，生理盐水稀释，4 ℃ 保存备用。

1.2.2 细胞培养 Capan-1 细胞培养于DMEM 培养基中，添加10%胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素，37 ℃，5% CO2条件下标准加湿培养箱孵育。

1.2.3 MTT 法检测细胞抑制率 选择对数生长期的细胞（5×103个细胞/孔）转移到96 孔板中，5% CO2培养箱中37 ℃孵育，贴壁后，加入终浓度分别为0、7.5、15、30、60、120、240 µg/mL 的LNT 的培养基溶液，空白对照组只加等量的培养基，另设置阳性对照组（60 µg/mL 顺铂，预实验获得）、0.1%的二甲亚砜（DMSO）组（对照组）、空白对照组（完全培养液）和只加培养基无细胞的空白组，每组设置3 个复孔，孵育48 h。每孔加入20 μL MTT 溶液。充分混合后，37 ℃孵育4 h，除去上清，加入150 μL 二甲亚砜溶液，37 ℃孵育30 min。随后，通过酶标仪检测490 nm 处的光密度（OD）值。抑制率（%）=（OD对照组-OD给药组）×100/（OD对照组-OD空白组）。GraphPad Prism 8 统计软件计算香菇多糖对Capan-1 细胞的IC50。

1.2.4 细胞分组及增殖率检测 选取对数生长期胰腺癌细胞，随机分组：对照组，正常培养；IL-6 组：IL-6 终浓度为50 ng/mL 的培养基培养[9]；IL-6+LNT 组：含50 ng/mL IL-6 和60 µg/mLLNT 的培养基培养。培养48 h 后，参照“1.2.3”采用MTT 法检测增殖率，增殖率（%）=（OD给药组-OD空白组）×100/（OD对照组-OD空白组）。

1.2.5 Western blot 检测相关蛋白水平 参照“1.2.4”分组，孵育48 h，RIPA 细胞裂解液裂解细胞，BCA法测定总蛋白水平。使用10% SDS-PAGE 分离蛋白，并转移到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。膜与一抗孵育过夜：p-STAT3（1:1000）、STAT3（1:1000）、Notch1（1:2000）、Hes1（1:2000），TBST 洗涤三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG （1:1000），37 ℃孵育1 h，TBST 洗涤三次，增强型化学发光试剂 （ECL）显现蛋白条带，Image J 软件分析结果。

1.2.6 细胞迁移能力检测 参照“1.2.4”分组，将Capan-1 细胞重悬于200 µL 无FBS 的培养基（1×105个细胞/孔）中，加入transwell 小室顶室。下腔添加10% FBS 的培养基。48 h 后，细胞固定染色，显微镜下随机选取6 个区域计数细胞数量。

1.2.7 细胞顺铂耐药模型的建立 对数生长期Capan-1 细胞置于处于含有0.1 μg/mL 顺铂（DDP）的培养基中培养2 周，调整DDP 浓度为0.2 μg/mL，继续培养2 周，将DDP 浓度分别调整至0.4、0.8 μg/mL，选择0.8 μg/mL DDP 存在下稳定生长的细胞被为抗DDP 的胰腺癌细胞Capan-1/DDP。

将Capan-1/DDP 细胞接种到96 孔板（5×103个细胞/孔），贴壁后分成3 组，包括对照组、IL-6、IL-6+LNT 组，每组加入DDP 终浓度分别为10、20、30、40 μg/mL 的培养基，孵育48 h，采用MTT 法检测490 nm 处的OD 值，计算增殖率，GraphPad Prism 8 软件计算顺铂半抑制浓度（IC50），Western blot 检测Ki-67、MMP-9、MRP1 和P-gp 表达水平。

1.2.8 裸鼠急性毒性试验 确定裸鼠最小剂量（Dm）和最大剂量（Dn），确定r值为0.7（r值代表相关系数）。设置LNT 剂量依次呈等比数列的5 个组别，每组10 只，各组裸鼠每天灌胃1 次，持续观察14 d。应用SPSS 21.0 软件中的Probit 模块计算LD50。所有动物实验均经校动物伦理委员会批准（批准号：2021-01011）。

1.2.9 动物模型建立及分组 0.2 mL 对数期Capan-1/DDP（1×107个/mL）细胞，接种于裸鼠侧腹，当肿瘤达到50～100 mm3时，分为模型组（生理盐水）、IL-6 组（5 μg/kg，预实验确定）、顺铂+IL-6 组[顺铂（4 mg/kg，预实验确定）+IL-6（5 μg/kg）]、IL-6+LNT组[LNT（80 mg /kg）+IL-6（5 μg/kg）]，每组8 只，均为腹腔给药，1 次/3 d，每周用卡尺测量异种移植瘤的大小（计算体积=最短直径2×最长直径/2）。给药21 d后，裸鼠给予安乐死，记录肿瘤重量。Western blot检测肿瘤组织中p- STAT3、STAT3、Notch1 和Hes1的水平。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 香菇多糖对胰腺癌细胞给药浓度的筛选

研究表明，香菇多糖是香菇中活性成分之一，具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成的作用[17]。香菇多糖由于其广谱的治疗特性、相对较低的毒性和成本，成为潜在和理想的联合化疗的免疫调节有效活性成分[18]。与相同浓度的顺铂比较，60 µg/mL 的LNT 对胰腺癌Capan-1 细胞抑制率无统计学差异（P＞0.05），说明相同浓度的LNT 与顺铂存在相同的药效。从图1中可以看出，与对照组比较，7.5、15、30、60、120、240 µg/mL LNT 组胰腺癌Capan-1 细胞抑制率极显著增加（P＜0.01）。通过GraphPad Prism 8 统计软件计算香菇多糖对胰腺癌Capan-1 细胞的IC50值为73.34 µg/mL，后续香菇多糖依据预实验浓度选择60 µg/mL。

图1 香菇多糖对Capan-1 细胞活力的影响Fig.1 Inhibitory effect of lentinan on Capan-1

2.2 LNT 对胰腺癌Capan-1 细胞增殖的影响

在肿瘤细胞中STAT3 激活与IL-6 和Notch 信号通路相关。高水平的IL-6 诱导STAT3 磷酸化，从而激活Notch 信号通路，促进细胞增殖。通过阻断STAT3 磷酸化，低水平的STAT3 磷酸化能切断IL-6和Notch 信号通路之家的联系[19]。而Notch 信号通路对癌细胞的增殖具有一定的影响，对癌症的进展发挥重要的作用[20]。同样，在本研究中，与对照组比较，IL-6 组增殖率显著上调（P＜0.05）（图2），提示高水平的IL-6 通过激活STAT3/Notch 信号调控胰腺癌Capan-1 细胞增殖，而LNT 可以通过抑制IL-6/STAT3/Notch信号通路抑制Capan-1 细胞增殖。

图2 LNT 对胰腺癌Capan-1 细胞增殖的影响Fig.2 LNT inhibited the proliferation of pancreatic cancer Capan-1 cells

2.3 香菇多糖对胰腺癌Capan-1 细胞中的 STAT3/Notch 信号通路的影响

已有研究表明，在部分癌细胞中，IL-6 通过STAT3 磷酸化激活Notch 信号通路，而Notch 信号通路可以促进肿瘤细胞的自我更新和增殖[21]。由图3 可知，与对照组比较，IL-6 组p-STAT3/STAT3表达水平极显著上调（P＜0.01），表明IL-6 可以促进STAT3 磷酸化，而p-STAT3 可以以二聚体的形式调控Notch1 及其下游Hes1 表达水平，而60 µg/mL LNT 可以逆转IL-6 对STAT3/Notch 信号通路的影响。与IL-6 组比较，IL-6+LNT 组p-STAT3/STAT3、Notch1 和Hes1 表达水平显著降低（P＜0.05），说明LNT 能够通过靶向STAT3/Notch 信号通路对Capan-1 细胞产生影响。

图3 LNT 对 STAT3/Notch 信号通路的影响Fig.3 Effect of LNT on STAT3/Notch signal pathway

2.4 LNT 对胰腺癌Capan-1 细胞迁移的影响

研究显示，肿瘤微环境中的促炎因子IL-6 具有激活IL-6/STAT3 信号通路，促进癌症发展的特征，包括癌细胞的迁移和侵袭[22-23]。本研究中，与对照组比较，细胞迁移率极显著增加（P＜0.01）（图4），说明IL-6 能刺激胰腺癌细胞迁移。而采用LNT 处理后，与IL-6 组比较，IL-6+LNT 组Capan-1 胰腺癌细胞迁移数目显著减少（P＜0.05），表明LNT 可以逆转IL-6通过STAT3 通路对Capan-1 胰腺癌细胞迁移的影响。

图4 LNT 对胰腺癌Capan-1 细胞迁移的影响Fig.4 LNTinhibits the migration of pancreatic cancer Capan-1 cells

2.5 LNT 对胰腺癌Capan-1 对顺铂耐药的影响

本研究中，伴随顺铂浓度的增加，对照组、IL-6 组以及IL-6+LNT 组Capan-1/DDP 细胞增殖率（极）显著下调（P＜0.05，P＜0.01）（图5），说明10～40 μg/mL的顺铂能有效抑制Capan-1/DDP 细胞增殖，并显示明显的浓度梯度依赖性。通过IC50值比较发现，与对照组比较，IL-6 组顺铂对Capan-1/DDP 细胞的IC50值极显著增加（P＜0.01），说明IL-6 能促进Capan-1/DDP 细胞的耐药性，这与相关报道一致[24]，因为IL-6 作为一种炎症相关的肿瘤细胞因子，能通过激活IL-6/STAT3 信号通路，激活下游一系列因子，导致癌细胞增殖、耐药、侵袭和转移等恶性行为的发生[25]。而采用LNT 处理后，与IL-6 组比较，IL-6+LNT 组顺铂对Capan-1/DDP 细胞的IC50值呈现极显著下调（P＜0.01），胰腺癌细胞耐药明显逆转，说明LNT 可能对治疗胰腺癌以及降低耐药性具有一定的调控潜力。

图5 LNT 抑制胰腺癌Capan-1 对顺铂耐药的影响Fig.5 Effect ofLNT inhibits cisplatin resistance in pancreatic cancer Capan-1

2.6 LNT 抑制胰腺癌Capan-1 中 Ki-67、MMP-9、Pgp 和 MRP1 的表达

Ki-67 在细胞周期的G1、S、G2 和M 阶段保持活性，为细胞增殖的标记物，而MMP-9 是基质金属蛋白酶最复杂的形式之一，具有降解细胞外基质（ECM）成分的能力，同样MRP1 的表达与癌细胞耐药有关，并激活多药耐药家族的有效成员p -糖蛋白（P-gp）的表达[26-28]。本研究中，与对照组比较，Ki-67、MMP-9、MRP1 和 P-gp 表达水平（极）显著上调（P＜0.05，P＜0.01）（图6），说明IL-6 能通过Ki-67、MMP-9 蛋白的表达促进胰腺癌细胞增值和迁移，并加强其耐药性。而采用LNT 处理后，与IL-6 组比较，IL-6+LNT 组Ki-67、MMP-9、MRP1 和 P-gp 表达水平显著降低（P＜0.05），进一步验证了LNT 抑制Capan-1 增值、迁移和耐药的原因，同时也间接说明IL-6 可能通过STAT3/Notch 通路调节Capan-1 胰腺癌细胞增殖、迁移和耐药。

图6 IL-6 对 Ki-67、MMP-9、P-gp 和 MRP1 表达的影响Fig.6 Effect of IL-6 on the expression of Ki-67, MMP-9, P-gp and MRP1

2.7 LNT 对裸鼠急性毒性试验

本实验最大给药量为6000 mg/kg，灌胃后，出现发抖、怕冷，扎堆，半小时后恢复正常，无死亡发生，根据外源化学物相对毒性分级标准，一次经口LD50在5000 mg/kg 以上为无毒，因此实际香菇多糖无毒。按照预实验最终取剂量为80 mg/kg。

2.8 LNT 对胰腺癌移植瘤顺铂耐药的影响

由图7 可知，本研究中，与模型组比较，IL-6 组瘤体体积、瘤重（极）显著上调（P＜0.05，P＜0.01），说明IL-6 促进了肿瘤的增殖；而与IL-6 组比较，IL-6+LNT 组瘤体体积、瘤重极显著下调（P＜0.01），说明LNT 可以发挥抑制IL-6 致瘤作用，下调瘤重水平。这与相关研究一致[29]，LNT 是从香菇中分离出来的β-（1,3）-葡聚糖多糖，已知具有低毒性和抗肿瘤活性，并有可能通过增强宿主的免疫能力、降低炎症水平间接发挥抗肿瘤作用[30]。

图7 LNT 对胰腺癌移植瘤顺铂耐药的影响Fig.7 Effect of L-6 on cisplatin resistance in pancreatic cancer xenografts

2.9 IL-6 对胰腺癌移植瘤 STAT3/Notch 信号通路的作用

在这项研究中，与对照组比较，IL-6 组Notch1、Hes1 表达水平极显著上调（P＜0.01）（图8），证明了IL-6 靶向Notch 信号后，能导致肿瘤细胞中STAT3出现过度激活，并进一步对Notch1、Hes1 产生影响。而LNT 和顺铂处理后，与IL-6 组比较，IL-6+LNT 组p-STAT3/STAT3、Notch1、Hes1 表达水平（极）显著下调（P＜0.05，P＜0.01），说明LNT 和顺铂能下调IL-6 对致瘤性的影响。

图8 IL-6 对胰腺癌移植瘤 STAT3/Notch 信号通路的作用Fig.8 Effect of IL-6 on STA T3/Notch signal pathway in pancreatic cancer xenografts

3 结论

本实验旨在研究LNT 对人胰腺癌的直接抗肿瘤作用及其对化疗敏感性的影响，并分析体内外机制。本研究中7.5～240 µg/mL 香菇多糖显著（P＜0.05）抑制胰腺癌Capan-1 细胞增值和迁移，下调p-STAT3/STAT3、Notch1 和Hes1 表 达 水 平，说 明LNT 香菇多糖能通过调控IL-6/STAT3/Notch 信号通路影响Capan-1 的增殖和迁移。针对Capan-1/DDP 耐药株结果表明，LNT 能下调其对顺铂的IC50，说明LNT增强了Capan-1/DDP 对顺铂的耐药敏感性。此外，通过体内实验表明，LNT 能下调瘤体体积、瘤重，降低p-STAT3/STAT3、Notch1、Hes1表达水平，这些结果都表明LNT 能有效抑制IL-6/STAT3/Notch 信号通路，抑制癌细胞增殖，增加耐药敏感性。本研究通过体内外实验阐明了LNT 抗胰腺癌的基本机制，为LNT 作为一种辅助抗癌药提供了新的认识，为胰腺癌的发生机制、临床治疗提供参考，同时也为香菇多糖的进一步开发提供依据。