黄精、陈皮、山楂提取液蒸制板栗的制备及其多糖对氧化应激小鼠血清抗氧化作用

檀兴慧，王文义，卢淑珍，吴水生，李德森,*，周 奕,*

（1.福建中医药大学药学院，福建福州 350122；2.福建中医药大学科技创新与转化中心，福建福州 350122）

衰老是医学史上一个重大的课题，据统计，2020年中国老龄化人口约占比18.73%，2010～2022 年间，65 岁及以上老年人每年约增加717 万人，年均增长率为4.83%[1]。现代医学研究表明，衰老与自由基、端粒酶等关联[2]。自由基学说指出机体衰老、脏器衰化会伴随集体防御系统中CAT、HO-1、SOD、GSHPx 等抗氧化酶的合成减少和活性降低，代谢产物MDA 过量生成，机体产生和清除自由基的平衡被破坏，自由基堆积[3]，可见，清除自由基是抗衰老的关键。

板栗在我国种植分布广、产量大[4]，其产区北起辽宁、吉林，南至广东、广西均有分布[5]。板栗富含蛋白质、淀粉、多糖、维生素C 等多种营养成分，其皮、果实等部位均可作药用[6]，具有药食两用价值，长期食用板栗不仅养胃健脾、补肾养颜，对老年慢性疾病，如腰膝酸软、腿脚不遂、筋骨疼痛等也有良好的作用[7]。此前，学者多围绕板栗栽培[8]、种资源[9]、品质评价[10]等方面开展研究。而其药用价值开发与药理作用研究尚处于探索阶段，已有研究表明板栗中的三萜、多糖、黄酮苷等成分具有抗菌、抗糖尿病、抗炎、抗凝血、抗癌、抗疲劳等多种生物活性[6]，其中多糖、维生素C 等成分抗氧化效果良好[11]。多篇报道显示，板栗有清除氧化自由基能力[12-13]，具有潜在延缓氧化衰老的价值。

目前，板栗主要加工产品包括板栗饮料、板栗酒、板栗糕点、板栗花纯露等，但其易褐变、霉变，难以长期保存及深加工[14]，目前存在产品总量小，市场上占有率低等劣势，亟需加大板栗功能食品研发。板栗的加工工艺多样，不同产地、不同加工方式、不同产地和不同加工方式的交互作用对板栗的营养成分和质构特性均有极显著影响[15-16]，现有的板栗产品研发注重其风味口感，对于其药用价值的挖掘尚不深入。因此，如何改变加工方式保留其营养价值是开发板栗功能产品的关键。基于此，在中医理论指导下，本研究通过搭配药食两用中药（陈皮、黄精、山楂，分别为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco 的干燥成熟果皮、百合科黄精属植物黄精Polygonatum sibiricumRed.的根茎、蔷薇科山楂属植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥果实），辅以中药炮制技术蒸制加工，获得新的板栗风味食品，增强其入肾、抗氧化应激作用，旨在获得具有更好的抗氧化抗衰老作用的板栗加工品，为板栗开发利用提供参考，促进板栗抗氧化抗衰老功能的开发与利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜品栗仁 唐山食栗派有限公司，批号2022 0219；陈皮饮片、黄精饮片 均购自安国市一方药业有限公司，批号分别为：21080902、21060203；山楂饮片 北京仟草中药饮片有限公司，批号：220217008；SPF 级ICR 小鼠 78 只，雄性，6～8 周龄，体质量22～25 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于SPF 级动物实验室，许可证号：SCXK（闽）2014-0005，24±2 ℃屏障环境中饲养，本实验经福建中医药大学动物伦理委员会审核通过；无水葡萄糖（批号：S22J12H137237）、D-半乳糖（批号：J07GS153840）均购自上海源叶生物有限公司；抗坏血酸（批号：J2112017） 阿拉丁试剂上海有限公司；小鼠HO-1 ELISA 试剂盒（批号：MH-55002M2）、小鼠GHS-Px ELISA 试剂盒（批号：MH-44117M2）、小鼠CAT ELISA 试剂盒（批号：MH-44125M2）、小鼠SOD ELISA 试剂盒（批号：MH-0389M2）、小鼠丙二醛（MDA）ELISA 试剂盒（批号：MH-0897M2） 均购自江苏酶免实业有限公司；苯酚、硫酸等 均为分析纯。

DTA-27F 型超声波清洗机 鼎泰（湖北）生化科技制造有限公司；TDL-40B 型低速离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-5200 型紫外-可见分光光度计上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总多糖含量测定方法的建立

1.2.1.1 对照品溶液 精确称取0.0100 g 无水葡萄糖于100 mL 容量瓶中，加超纯水溶解定容至刻度，即得浓度为0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。

1.2.1.2 供试品溶液 精密称定1.000 g 板栗粉末于50 mL 离心管中，加入超纯水30 mL，室温下以超声波功率100 W 提取1 h，3500 r/min 离心10 min，吸取上清液0.5 mL 于25 mL 容量瓶中，加超纯水定容至刻度，备用。

1.2.1.3 标准曲线的制备 精确量取0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mL 葡萄糖标准溶液，分别置20 mL 具塞试管中，加超纯水至1 mL，摇匀，加入5%苯酚1 mL，后迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冷水浴中降至室温后，置沸水浴加热15 min，再置冷水浴中降至室温，于490 nm 测定吸光度[17]。以葡萄糖溶液浓度（x）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线：Y=0.01x-0.0232，R2=0.9992，x 的浓度单位为：μg/mL，线性范围10～80 μg/mL，线性关系良好。

1.2.1.4 总多糖含量测定 分别准确量取各组供试品溶液0.5 mL 于20 mL 具塞试管中，加水至1 mL，后续按照“1.2.1.3”方法进行检测，平行测定数值3 次。

注：A 为测得吸光度值；n 为稀释倍数：3000。

1.2.2 正交试验优化板栗蒸制工艺

1.2.2.1 中药蒸制板栗的制备 将陈皮、山楂、黄精剪碎约5 mm 大小，称取适量，加入150 mL 20%食用乙醇，浸泡16 h，得药食两用中药药液；将鲜品板栗仁，洗净沥干，称取120 g 置于药液中，以超声功率700 W、35 ℃的条件超声30 min[18]，超声结束后再室温浸泡60 min。参考中药熟地黄的加工方法，将浸泡好的板栗仁取出，平铺于蒸制器皿中，待蒸锅“圆汽”后，中火蒸制30 min，以上述方法重复浸泡、蒸制一次，即得黄精、陈皮、山楂中药蒸制板栗。

1.2.2.2 对照组板栗的制备 以20%食用乙醇作为浸泡板栗的溶液，按“1.2.2.1”中的浸泡、蒸制条件加工生品板栗作为对照组板栗。

1.2.2.3 单因素实验 按上述板栗蒸制工艺，以山楂3 g，陈皮6 g，研究不同剂量黄精（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）制得的提取液蒸制对板栗感官评价的影响；以黄精2 g，山楂3 g，研究不同剂量陈皮（1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g）制得的提取液蒸制对板栗感官评价的影响；以黄精2 g，陈皮4.5 g，研究不同剂量山楂1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g）制得的提取液蒸制对板栗感官评价的影响。

1.2.2.4 正交试验设计 采用陈皮、山楂、黄精用量为考察因素，各取三个水平，按L9（34）进行正交试验，见表1。评价指标：以感官评价和总多糖含量为评价指标，进行综合评价；其中总多糖含量权重系数为0.7，感官评价权重系数为0.3。

表1 正交试验设计因素与水平Table 1 Orthogonal experiment design factors and levels

1.2.2.5 感官评价标准 本研究参考文献[19]制定感官评价标准见表2，分别对板栗的色泽、滋味与香气等感官指标进行分值评定。感官评定人员20 名，均为食品科学专业学生，在评定前12 h 饮食清淡，每感官评定一个样品后用清水漱口再评另一样品，评定过程中不允许相互交谈，同时填好评分表并签名，由试验人员收集评分表进行数据分析。

表2 板栗感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standard of chestnut

本试验采用10 分制，各感官指标权重分别为：色泽40%、滋味与香气60%。各项评价之和为该样品的最终得分。感官评价分值采用算数平均值法进行。

1.2.3 板栗蒸制前后对小鼠小肠运动的影响

1.2.3.1 板栗水溶液制备 取板栗与蒸制板栗120 g，分别加入3 倍量水，置料理机内打成糊状物，加水定容，制成0.3 g/mL 的板栗水溶液，备用。

1.2.3.2 分组及干预 取SPF 级ICR 小鼠18 只，雄性，体质量22～25 g。随机分为空白组、板栗组和蒸制板栗组，每组6 只。各给药组分别按体质量10 mL/kg 灌胃板栗水溶液，空白组灌胃生理盐水，2 次/d，给药间隔时间为12 h，同时将板栗组、蒸制板栗组饲料换成相对应的板栗，连续灌胃3 d。

1.2.3.3 炭末推进法 末次给药前，禁食不禁水12 h，将含有5%炭末的板栗水溶液按体质量10 mL/kg灌胃，30 min 后按“炭末推进试验法”，脱颈椎处死小鼠，剖开腹腔，分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，以直尺测定肠管长度作为小肠总长度，从幽门至炭末前沿的距离作为炭末在肠内推进距离[20]，计算炭末推进率。

1.2.4 板栗总多糖抗氧化应激作用

1.2.4.1 板栗多糖的提取 分别称取板栗、蒸制板栗240.0 g，加超纯水2400 mL（料液比1:10），以超声波提取功率100 W，常温常压超声提取35 min，再以80 ℃水浴加热1 h[21]，离心，取上清液，旋蒸浓缩，浓缩液加95%乙醇，醇沉浓度80%，4 ℃静置16 h，沉淀抽滤、洗涤，置蒸发皿冷冻干燥，得板栗多糖12.414 g，得率5.17%；蒸制板栗多糖18.735 g，得率7.81%。冻存至-20 ℃，备用。

1.2.4.2 D-半乳糖诱导小鼠氧化应激及板栗多糖干预 取6～8 周龄的SPF 级ICR 雄性小鼠60 只，体质量22～25 g，随机分为：空白组、模型组、维生素C 组、板栗多糖组、蒸制板栗多糖组，每组10 只。除空白组外，其余各组每日按10 mL/kg 腹腔注射2.5%D-半乳糖（D-galactose，D-gal）溶液，连续注射5 周。空白组及模型组灌胃等体积生理盐水，阳性对照组灌胃100 mg/mL 维生素C 溶液[22]，板栗多糖组、蒸制板栗多糖组按剂量相当于12 g/kg 生药材配成溶液灌胃给药，以上各组均按体质量10 mL/kg 进行干预，1 d/次，连续5 周；采用1%戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，摘眼球取血，血液经3500 r/min、4 ℃离心15 min，取上清用于后续生化检测。

1.2.4.3 氧化应激小鼠血清抗氧化酶活性测定 采用酶联免疫法，参照试剂盒说明书操作，检测各组小鼠血清中CAT、HO-1、SOD、GSH-Px 活性水平及MDA 含量。

1.3 数据处理

采用SPSS 23.0 软件对实验数据进行处理及统计学分析，结果以Mean±SD 表示。应用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行组间比较，P＜0.05 或P＜0.01 表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 黄精用量对感官评价的影响 如图1 所示，蒸制板栗感官评价的得分随黄精的添加的增加呈先增加后下降趋势，当添加量大于2.0 g 后开始下降。这是由于中药黄精本身存在药味会干扰蒸制板栗的味道，使药味掩盖板栗本身香味，从而导致感官评价得分降低，故选取黄精的添加量为2.0 g 进行下一步试验。

图1 黄精用量对感官评价的影响Fig.1 Effect of Polygonatum dosage on sensory evaluation

2.1.2 陈皮用量对感官评价的影响 如图2 所示，蒸制板栗感官评价的得分随陈皮的添加的增加呈先增加后下降趋势，当添加量大于4.5 g 后开始下降。这是由于陈皮本身香气与板栗香气融合，干扰蒸制板栗的味道，且陈皮的风味会掩盖板栗的香味，从而导致感官评价得分降低，故选取陈皮的添加量为4.5 g 进行下一步试验。

图2 陈皮用量对感官评价的影响Fig.2 Effect of Citrusreticulata dosage on sensory evaluation

2.1.3 山楂用量对感官评价的影响 如图3 所示，蒸制板栗感官评价的得分随山楂的添加的增加呈先增加后下降趋势，当添加量大于3.0 g 后开始下降。这是由于山楂带有酸味，适当添加能解腻，但添加量过多会导致蒸制板栗过酸，影响口感，从而导致感官评价得分降低，故选取山楂的添加量为3.0 g 进行下一步试验。

图3 山楂用量对感官评价的影响Fig.3 Effect of Crataegus pinnatifida dosage on sensory evaluation

2.2 正交试验优化板栗蒸制工艺

L9（34）正交试验中各实验组板栗多糖含量，蒸制工艺条件及正交实验结果见表3，方差分析见表4。由直观分析可知，影响蒸制板栗总多糖含量和感官评价效果的因素主次顺序为：A＞B＞C，即陈皮＞山楂＞黄精。经方差分析，最终确定最佳中药用量方案为A2B2C1，即蒸制120 g 板栗需陈皮4.5 g、山楂3 g、黄精3 g，测得对照组板栗多糖含量为69.65±0.98 mg/g；经药食两用中药制成的蒸制板栗，感官评价得分为：89.2±0.56；多糖含量为：97.10±0.16 mg/g。

表3 正交试验设计方案与结果Table 3 Scheme and results of orthogonal experiment design

表4 综合评分方差分析Table 4 Comprehensive analysis of variance

2.3 板栗对小鼠小肠运动的影响

与空白组相比，板栗组小鼠肠推进率小于空白组，但无显著性差异（P＞0.05），蒸制板栗组小鼠肠推进率显著提高（P＜0.05）；与板栗组相比，蒸制板栗组肠推进率显著提高（P＜0.01），见图4，表明经陈皮、山楂、黄精蒸制后的板栗可有效促进小鼠小肠运动。

图4 板栗对小肠运动的影响Fig.4 Effect of Chestnut on small intestinal motility

2.4 氧化应激小鼠血清抗氧化酶活性测定

由见图5 可知，与空白组相比较，模型组小鼠血清中SOD、GSH-Px、HO-1、CAT 活性明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），MDA 活性明显提高，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明D-gal 诱导氧化应激成功；与模型组相比，蒸制板栗多糖组的GSHPx、HO-1、CAT 活性极显著提高，差异具有统计学意义（P＜0.001），SOD 也明显提高（P＜0.05），MDA 活性显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明经陈皮、山楂、黄精蒸制后的板栗具有良好的抗氧化效果，可有效改善D-gal 诱导的小鼠衰老，此外，与板栗多糖组对比，蒸制板栗组CAT 显著提高（P＜0.05），提示板栗多糖、蒸制板栗多糖均有抗氧化活性，蒸制板栗组整体抗氧化活性较板栗多糖组高（P＜0.01）。

图5 血清中SOD、GSH-Px、HO-1、CAT、MDA 含量Fig.5 Content of SOD, GSH-Px, HO-1, CAT, and MDA in the serum

3 讨论与结论

中医药在改善机体免疫能力，抗氧化应激和衰老有其独特的优势。多糖广泛存在于药用植物及微生物的细胞壁、动物细胞膜中，其可通过提高机体抗氧化、调节免疫作用、对应激反应的影响及延长生长期等方面对机体起到延缓衰老的作用[23-24]。从食用安全性和保健功效两角度考量，药食两用中药是开发保健食品和寻找抗氧化抗衰老药物的潜在资源。板栗风味良好，具有补肾、抗衰老的作用，多糖是其有效物质之一，然而板栗生吃不易消化，熟吃又滞气[25]。黄精[26-27]、山楂[28]、陈皮[29-30]消食健胃、行气化瘀，富含多糖和黄酮，且具有抗氧化自由基损伤的活性。为进一步增强板栗抗氧化功效、改善其消化不良消化的弊端，本研究参考中药熟地黄、黄精等炮制工艺，提取中药活性成分对板栗进行蒸制加工；基于感官评价和多糖含量，以总多糖为主要评价指标，采用苯酚-浓硫酸法测定板栗蒸制前后总多糖含量[31]，优选黄精、山楂、陈皮提取液蒸制板栗的工艺为：每100 g 蒸制板栗含板栗91.95%，陈皮3.45%、山楂2.30%、黄精2.30%，对照组板栗多糖含量为：69.65±0.98 mg/g；经药食两用中药提取液蒸制板栗中多糖含量为：97.10±0.16 mg/g。

为明确蒸制前后机体对板栗的消化情况，本研究借助肠推进实验，通过每天2 次，连续3 d 给正常小鼠灌胃板栗，模拟板栗多食造成消化不良的情况，在末次灌胃半小时后进行肠道推进检测，结果显示，连续3 d，每天2 次给予板栗会造成小鼠肠道推进减慢，与板栗组对比，药食两用中药蒸制后的板栗促进肠推进具有显著差异（P＜0.01），表明板栗借助山楂、陈皮消食的功效改善自身消化不良的弊端；为进一步明确药食两用中药蒸制板栗对小鼠血清氧化应激的影响，本研究采用D-gal 诱导，构建氧化应激衰老动物模型[32]，发现D-半乳糖诱导的小鼠相较空白组更明显出现氧化应激，氧化应激产物MDA 含量显著升高（P＜0.05），经板栗经中药蒸制前后，其多糖均可有效促进体内防御系统中抗氧化酶系SOD、GSH-Px、HO-1、CAT 的合成或活性增强，降低代谢产物MDA的活性，防止自由基堆积。

本研究借鉴中药炮制，提出板栗新的加工方法，提供了一种新的板栗加工品，可为同类食药两用中药的开发利用提供参考，可促进板栗资源的利用，利于多种类板栗保健品的开发，提升板栗在抗氧化抗衰老研究方面的附加值。本研究不足之处在于，尚未完全阐明板栗补肾机制，仅从血清水平阐明其具有抗氧化作用，未能在更深的作用机制层面阐明板栗通过何种途径补肾，从而抗氧化抗衰老，这亦是现代研究的不足之处。板栗作为一种风味良好的食品，在中医药领域亦是补肾佳品，如何实现中医药学与食品科学的有机结合，一直是中医药学者研究的热点，本研究仅提供一点微薄思路，供做参考。在本研究水平上，药食两用中药蒸制的板栗可改善板栗本身不易消化的缺点，且其多糖在抗氧化抗衰老作用。然而板栗中营养成分含量丰富，对板栗中是否还存在其他具有显著抗氧化、抗抗衰老作用的成分及板栗抗衰老作用机制还需进一步深入研究。