兴安升麻醇提物成分分析及基于网络药理学探讨其促进皮肤伤口愈合的作用机制

李艳娜，张富源，程伟峰，桑亚新，王向红,*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000；2.河北雅果食品有限公司，河北保定 071000）

升麻属植物为毛茛科多年生草本植物，约有10 余种主产于我国各地[1]。升麻在我国是一种常用中药，也是药食同源目录中的一种食物，为大三叶升麻、兴安升麻和升麻的干燥根茎。由于其具备成本较低、毒副作用较小、不易产生耐药性等优点，三个升麻品种均被收录于2015 年版《中国药典》[2]。其中，兴安升麻又名为苦老芽、窟窿牙，在我国广泛分布于内蒙古、山西、河北、辽宁和黑龙江等地[3]。作为一种药用植物，兴安升麻具有清热解毒、发表透疹等功效，常被用于治疗咽喉肿痛、风热头痛、子宫脱垂等病症[2]。它又是一种纯天然的山野菜，将刚生长出的嫩芽制作后食用，入口微苦、先苦后甜，有良好清热败火、抗菌消炎功效，食疗效果较好[4-7]，具有较高研究价值。

研究发现，升麻属植物中富含多种活性成分，具有重要的药理活性功能，如抗病毒、抗炎、抗骨质疏松、治疗妇女更年期综合症等[8-10]，在维护人体健康及防治相关疾病方面具有较高的研究价值。升麻属植物中酚酸类、萜类等化合物是较好的抗炎活性成分，如阿魏酸、异阿魏酸等。我国每年约有超过1000 万人遭受皮肤创伤，当皮肤受损后，皮肤的完整性及功能性会受到破坏，迫使血管破裂、引发炎症反应、造成机体的感染，甚至危及生命[11-12]。因此，作为连接机体与外界环境的第一关，快速修复皮肤创伤至关重要[13]。但是伤口愈合的速度及愈合质量会受到诸多因素的影响，其中，伤口炎症、细菌感染是影响伤口愈合的重要因素之一。前期研究发现，具有良好抗菌消炎作用的兴安升麻能够有效促进伤口愈合，严格防止细菌感染[14]，但是由于其成分复杂，对于发挥药效活性成分群及作用机制尚不清晰。

网络药理学是一门多学科技术和内容相结合的交叉学科，通过分析生物网络解释药物成分与疾病靶点之间的复杂关系，并揭示其作用机制[15-16]。Deng等[15]探索了桔梗治疗肺癌的潜在作用机制，表明桔梗可能是通过MAPK 和P13K-AKT 等潜在信号通路来治疗肺癌。基于网络药理学研究发现桃红四物汤主要通过抑菌作用及改善血液流变学等途径，治疗关节置换后假体周围感染[17]。因此，基于网络药理学方法分析药物与机体之间的关系已经受到研究者的广泛关注，逐渐成为研究热点，但尚未见与基于网络药理学预测兴安升麻作用机制的相关研究。

由于兴安升麻发挥促进皮肤伤口愈合功效的活性成分及作用机制尚不明确，本研究以兴安升麻为原料，采用醇提法提取生物活性物质，并通过HPLCMS 技术分析鉴定兴安升麻醇提物的活性化学成分。通过网络药理学进一步分析预测其促愈作用机制，以期为兴安升麻的开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兴安升麻（Cimicifuga dahurica(Turcz.) Maxim.） 购于河北省张家口市，多年生草本植物；无水乙醇 纯度≥95.0%，天津市富宇精细化工有限公司；乙腈 纯度≥99.9%，上海拜力生物科技有限公司；甲酸 色谱纯，梯希爱化成工业发展有限公司；甲酸铵 纯度≥99.9%，西格玛奥德里奇贸易有限公司。

RE-52A 型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 保定高新区阳光科教仪器厂；FD5-2.5 型真空冷冻干燥机 SIM 仪器有限公司；H1850-R 型冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；U3000 型液相色谱仪、QE Focus 高分辨质谱仪 赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 兴安升麻活性物质的提取 将兴安升麻冻干，粉碎，过60 目筛。称取5 g 粉末，加入60 mL 78%乙醇混合均匀，在室温条件下醇提3 次，每次静置提取12 h。将醇提液合并、过滤，8000 r/min 离心5 min，收集上清液于37 ℃下旋蒸除去乙醇，再经冷冻干燥，最终获得醇提物干粉。

1.2.2 化学成分的鉴定 通过HPLC-MS 检测，根据精确分子量及数据库筛选分析兴安升麻醇提物的化学成分，并应用面积归一法进行定量[18]。

1.2.2.1 色谱条件 采用ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 µm）色谱柱，自动进样器温度设为8 ℃，以0.25 mL/min 的流速，40 ℃的柱温，进样2 µL 进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；负离子5 mmol/L 甲酸铵水（A）-乙腈（B）。

1.2.2.2 质谱条件 仪器使用电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率70000 进行全扫描，扫描范围81～1000 aum。

1.2.3 靶点的筛选及预测 利用Pubchem 数据库获取兴安升麻化学成分的结构，将其导入SwissADME数据库，以“胃肠道吸收为高且类药性满足两个条件”为标准，并结合文献筛选出有效成分，并根据靶点可能性通过SwissTargetPrediction 数据库筛选及预测有效成分的潜在靶点，再利用UniProt 蛋白数据库筛选出具有相应基因的有效靶点。以“皮肤伤口（skin wound）”为关键词，通过GeneCards、OMIM及DrugBank 数据库搜索与此相关的疾病靶点。将其与兴安升麻的有效靶点进行匹配，得到兴安升麻促进皮肤伤口愈合的相关靶点。

1.2.4 “药物-成分-疾病-靶点”网络图的构建 采用Cytoscape3.9.0 软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络，并进行可视化分析。其中，节点分别代表药物、有效成分、皮肤伤口及靶点，边代表节点之间的相互关系。

1.2.5 蛋白互相作用网络的构建 将交集靶点导入String 数据库，进行蛋白互相作用分析，以得分≥0.7 为标准筛选相互作用关系，并根据degree 值筛选出前20 个靶点作为核心靶点；将其导入Cytoscape软件，构建蛋白相互作用网络图。

1.2.6 生物功能的分析 利用DAVID 数据库对核心靶点进行GO 和KEGG 富集分析，得到兴安升麻促进皮肤伤口愈合的主要作用通路；并将结果导入微生信平台构建富集分析结果图。

1.3 数据处理

对高分辨质谱数据进行分析，通过Proteowizard 软件将获得的原始数据转换成mzXML 格式，利用XCMS 程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐。根据精确分子量（分子量误差为≤30 ppm）、保留时间等进行物质鉴定，后续根据MS/MS 碎片模式对HMDB、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound、以及帕诺米克自建标准品数据库确认注释获得活性物质，并采用面积归一化法测定各成分的相对含量。通过数据库筛选并预测成分、疾病靶点相关信息，利用Cytoscape3.9.0 软件、微生信平台分析筛选结果并绘图。SwissTargetPrediction 数据库（http://swisstargetprediction.ch/）；SwissADME 数 据 库（http://www.swissadme.ch/）；PubChem 数据库（http://pubmed.cn/）；UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）；GeneCards 数 据 库（ https://www.genecards.org/） ；OMIM 数据库（https://www.omim.org/）；DrugBank数 据 库（https://go.drugbank.com/）；String 数 据 库（https://www.omim.org/）；DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape3.9.0 软件；微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/en）。

2 结果与分析

2.1 醇提物化学成分结果分析

本研究从兴安升麻中共鉴定出125 种化学成分（表1），其中萜类（24.05%）、苯丙素类（23.23%）和酮类（20.61%）化合物占比较高，另外还鉴定到酚类（6.69%）、生物碱类（5.16%）、糖类（3.03%）、醌类（1.98%）、香豆素类（1.60%）和木脂素类（1.01%）等化合物。共有21 种化学成分相对含量大于1%，主要包括隐绿原酸（10.52%）、绿原酸（10.27%）、白术内脂III（8.46%）、莪术二酮（5.10%）、5-羟甲基糠醛（4.77%）、高车前素（4.73%）等，其中隐绿原酸、绿原酸为苯丙素类化合物，白术内脂III 与莪术二酮为萜类化合物；升麻属植物主要生物活性成分为苯丙素类化合物、三萜皂苷或其苷元，以及色酮类、生物碱类、糖类、含氮化合物等[19-21]。多酚类、酮类、生物碱类等部分化合物具有显著的抗炎功效，能够在伤口愈合过程中发挥作用[22-23]。

表1 兴安升麻醇提物化学成分Table 1 Chemical compositions of alcohol extracts from Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.

2.2 靶点筛选结果分析

对兴安升麻活性成分的定性定量分析并不能确切证明其疗效，也难以确定发挥治疗功效的有效成分及作用机制，因此基于网络药理学进行靶点筛选及预测，进而分析其促愈作用机制。

2.2.1 化学成分靶点筛选及预测结果 对兴安升麻的125 种化学成分进行类药性筛选，并查阅文献[24-25]，保留可能与“促进皮肤伤口愈合”相关性较高的化学成分，最终筛选共得到99 种有效成分，并筛选及预测到860 个目标靶点。

2.2.2 疾病靶点筛选及预测结果 以“skin wound”为关键词，利用GeneCards、OMIM 和DrugBank 数据库分别筛选出622、215 和44 个疾病靶点，经整理去重后获得804 个相关靶点。

2.2.3 成分-疾病交集靶点筛选结果 由图1 可知，兴安升麻有效成分靶点与皮肤伤口靶点取交集后共得到159 个交集靶点，其为兴安升麻促进皮肤伤口愈合的相关靶点。

图1 “成分-疾病”靶点Veen 图Fig.1 Veen diagram of "component-disease" targets

2.3 “药物-成分-疾病-靶点”网络图构建结果分析

对兴安升麻有效成分进行编码（表2），将药物、成分、疾病及靶点关系导入Cytoscape3.9.0 构建网络图。如图2 所示，去除相互作用较弱的游离点，图中共有256 个节点，粉色箭头状节点代表兴安升麻，紫色圆形节点代表95 种有效成分，绿色箭头状节点代表皮肤伤口，蓝色圆形节点代表159 个靶点；1049条边代表节点之间的相互关系。分析发现，兴安升麻中不同的有效成分可作用于一个或多个靶点，说明兴安升麻的多成分、多靶点作用于促进皮肤伤口愈合的特性。以Degree 值为判断标准（Degree 值≥25），前20 种与靶点相关性较强的兴安升麻茎叶有效成分包括：橘皮素、山姜素、5-去甲川陈皮素、高车前素、甘草查尔酮B、内华达素、甜橙黄酮、艾黄素、金腰乙素、异泽兰黄素、异鼠李素、柳穿鱼素、大黄素-甲醚、芥子酸、蔓荆子黄素、美迪紫檀素、紫胶桐酸、二氢白藜芦醇、木兰花碱、木香内酯，这些物质大多数为酮类化合物，还有少量的苯丙素类、生物碱类及酚类化合物。以Degree 值为判断标准（Degree 值≥18），前20 个与兴安升麻茎叶有效成分相关性较强的靶点包括：CYP19A1、EGFR、MMP13、MMP2、ABCB1、 MMP12、 PTGS2、 MMP9、 TYR、 MET、ALOX5、CYP1B1、ESR1、MMP1、TERT、KDR、SRC、MMP8、F2、AR。其中，EGFR、KDR、F2 靶点可能在此过程中发挥重要作用。

2.4 蛋白相互作用网络构建结果分析

根据兴安升麻促进皮肤伤口愈合的作用靶点，结合他们之间的蛋白相互作用，利用Cytoscape3.9.0构建交集靶点的蛋白互作网络图。如图3a 所示，图中共有150 个节点代表不同靶点，1300 条边代表靶点间的相互关系，图中节点由大到小、颜色由紫到黄代表节点degree 值逐渐减小。如图3b 所示，排名前20 的PPI 核心靶点依次为：SRC、STAT3、EGFR、HRAS、TP53、AKT1、MAPK3、CTNNB1、PIK3R1、VEGFA、TNF、PIK3CA、MAPK1、JUN、IL1B、NRAS、MAPK8、RELA、MMP9、PTK2，这些靶点可能在兴安升麻促进皮肤伤口愈合靶标网络中发挥重要作用。

图3 “成分-疾病”PPI 分析网络图（a）和核心靶点网络图（b）Fig.3 Network diagram (a) and core target network diagram (b) of the PPI analysis of ''component-disease''

2.5 GO 和KEGG 富集结果分析

如图4 所示，对核心靶点进行GO 富集分析，选取显著性较强的前15 条相关联术语做可视化分析，从左到右P值逐渐增大、显著性逐渐减弱；柱状图的长度越长，富集的差异基因数量越多。

图4 核心靶点GO 富集分析图Fig.4 GO enrichment analysis of core targets

结果表明，在生物过程方面，共有221 条相关联术语，主要参与蛋白质磷酸化的正调控（positive regulation of protein phosphorylation）、ERBB2 信号通路（ERBB2 signaling pathway）、Fc-ε受体信号通路（Fc-epsilon receptor signaling pathway）、凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）、表皮生长因子受体信号通路（epidermal growth factor receptor signaling pathway）等过程；在细胞组件方面，共有29 条相关联术语，主要存在于胞浆（cytosol）、细胞核（nucleus）、粘着斑（focal adhesion）、蛋白质复合物（protein complex）、细胞膜（caveola）等组件中；在分子功能方面，共有44 条相关联术语，主要涉及相同的蛋白质结合（identical protein binding）、激酶活性（kinase activity）、转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、酶结合（enzyme binding）等分子功能。

将核心靶点进行KEGG 通路富集分析，共富集到106 条相关联通路，如图5 所示，选取显著性较强的前20 条通路做可视化分析，颜色由粉到蓝代表P值逐渐增大、显著性逐渐减弱；圆形图越大，富集的差异基因个数越多。结果显示，富集到的相关信号通路主要包括癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、癌症的途径（Pathways in cancer）、ErbB 信号通路（ErbB signaling pathway）、丙型肝炎（Hepatitis C）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、催乳素信号通路（Prolactin signaling pathway）、子宫内膜癌（Endometrial cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、VEGF 信号通路（VEGF signaling pathway）、粘着斑（Focal adhesion）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）等。认为经兴安升麻介导后，VEGF、EGFR 和TNF 信号通路可能通过调控相关因子和蛋白的表达，在促进皮肤伤口愈合方面发挥重要作用。

图5 核心靶点KEGG 富集分析图Fig.5 KEGG enrichment analysis of core targets

3 讨论与结论

兴安升麻在我国资源丰富，种植广泛，作为一种药食同源植物在河北地区深受人们喜爱。前期研究发现，兴安升麻能够有效促进皮肤伤口愈合[14]。皮肤创伤修复是一项复杂而精密的动态过程，利用信号网络进行精准的执行和调控；而网络药理学是一个基于信息检索、数据分析及网络构建的领域。因此本研究基于网络药理学进一步分析了兴安升麻对皮肤伤口的促愈机制，发现兴安升麻的多成分、多靶点作用于促进皮肤伤口愈合的特性；其中橘皮素、山姜素、5-去甲川陈皮素等成分可能在促进皮肤伤口愈合过程中发挥重要作用。已有研究证实以橘皮素为主要多酚物质的小花山奈具有抗氧化和抗炎活性，能够抗皮肤炎症[26]；山姜素能够有效减轻溃疡性结肠炎小鼠肠道炎症，并改善小鼠肠上皮屏障功能[27]；5-去甲川陈皮素也具有抗炎活性，能够抑制小鼠耳部炎症的形成及损伤[28]。“药物-成分-疾病-靶点”分析发现EGFR、KDR、F2 靶点也在此过程中发挥重要作用。EGFR 基因提供了制造表皮生长因子受体的受体蛋白的指令，能够促进细胞的生长繁殖[29]；KDR 基因所编码的蛋白VEGFR-2，是血管生长因子重要信号转导的重要受体，具有调控血管内皮细胞增生、趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能[30]；F2 基因提供了制造凝血酶原的蛋白质的指令，对细胞生长和分裂、组织修复和新血管形成、血液凝固具有重要作用[31]。通过靶点与疾病的相关分析，认为VEGF、EGFR 和TNF 信号通路可能通过调控相关因子和蛋白的表达，在促进皮肤伤口愈合方面发挥重要作用。VEGF信号通路是调控心血管生成的重要信号通路，调控与新血管生成相关的下游基因，促进血管内皮细胞的增殖、迁移、存活，控制心血管的生成，促进皮肤伤口愈合[32-33]。EGFR 信号通路可以促进表皮细胞、成纤维细胞的增殖和其他生长因子的合成，进而加速皮肤伤口表皮的愈合与再生[34-35]。TNF 信号通路通过调控炎症因子和相关蛋白的表达，进而实现伤口清创及愈合[36]。

本研究通过HPLC-MS 检测兴安升麻醇提物的化学成分，从中共鉴定出125 种化学成分，其中包括大量萜类、苯丙素类、酮类、酚类化合物，以及生物碱类、糖类、醌类、香豆素类和木脂素类等化合物，且隐绿原酸、绿原酸、白术内脂III 为含量最高的三种活性成分。进一步基于网络药理学预测其促愈保护作用，结果表明兴安升麻中的活性成分可作用于一个或多个靶点，EGFR、KDR、F2 等重要靶点及橘皮素、山姜素、5-去甲川陈皮素等活性成分可能在此过程中发挥重要作用，说明兴安升麻多成分、多靶点作用于促进皮肤伤口愈合的特性；经兴安升麻介导后，VEGF、EGFR 和TNF 信号通路可能通过调控相关因子和蛋白的表达，发挥对皮肤伤口的促愈作用。本研究结果明确了兴安升麻的活性成分，并基于网络药理学分析了其对皮肤伤口的促愈作用机制，为后续对兴安升麻的开发与应用提供理论支撑。