梵净山石斛开花特性及繁育系统研究

刘芳任启飞胡世俊马菁华陈云飞欧明烛李海波

(1.西南林业大学林学院，云南 昆明 650224；2.贵州省植物园，贵州 贵阳 550004；3.贵州梵净山国家级自然保护区管理局，贵州 铜仁 554400)

梵净山石斛(Dendrobium fanjingshanense)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)附生草本植物，是2001年发现的1个新种[1]，其分布区域狭窄，在中国目前发现有分布的只有2个地方：贵州省梵净山黑湾河，浙江省九龙山国家级自然保护区[2]。梵净山石斛是濒危植物，被列入现已被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物，其主要附生在乔木树种上，分布高度为15～20m，其开花率高但结实率极低，是一种适应性较强、喜湿、喜阴凉的植物[3，4]。梵净山石斛具有药用价值，可入药用于治疗口干、烦渴、热病伤津、肺热干咳、腰膝软弱、阴伤目暗等病症[5]；此外，其作为石斛兰，其花黄褐色或橙黄色，具有极高的观赏价值和育种价值。

目前，对梵净山石斛的研究报道不多，主要集中在亲缘关系、繁殖技术和营养成分等方面，研究表明，梵净山石斛与细茎石斛亲缘关系较近[6]。余水生等[7]进行了梵净山石斛种子无菌播种技术研究；杨天友等[8]测定了梵净山石斛的营养成分，其含有丰富的营养成分，水浸出物含量最高，粗多糖含量次之，还含有粗纤维、蛋白质、脂肪、总黄酮以及矿质元素钾、钠、钙、镁、铁、锌等营养成分，除此之外，其还含有16种氨基酸和10种脂肪酸。梵净山石斛与铁皮石斛营养成分相比也具有一定优势，含有铜、钙、镁、钾及硒5种矿质元素，醇溶性浸出物，石斛碱的含量较高，但粗多糖的含量低[9]。

繁育特性是兰科植物保育的基础[10]，石斛兰在自然情况下结实率低[11]，因此，在人工栽培条件下，研究其人工授粉技术，提高梵净山石斛的结实率，对其繁殖和育种具有重要的意义。目前，对于梵净山石斛没有繁育生物学相关研究报道，本试验以梵净山石斛为研究对象，开展其开花特性观测以及人工授粉研究，并对蒴果的发育进行了观测，为其繁育研究提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为种植于贵州省植物园保育温室内的梵净山石斛植株，栽培基质为鹿沼土∶树皮∶蛭石=2∶2∶1。选择生长较好的植株进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 花期各阶段观察及花部结构测定

2023年2—4月，参考李伟倩[12]的方法，观察花期各阶段，直至花期结束。随机抽取10朵梵净山石斛盛开的花朵，放入保鲜袋中带回实验室，测量中萼片、花瓣、子房、合蕊柱的大小。

1.2.2 人工授粉

参考李桂琳等[13]方法。于盛花期的早晨进行人工授粉，设置自花授粉、同株异花、异株异花3个处理，授粉花朵数视实际情况而定，授粉时用大头针轻轻挑开药帽后轻沾花粉粒放到待授粉花朵的蕊腔里，轻压使其与蕊腔紧密接触。授粉前后1d内不浇水。授粉7～14d后观察授粉花朵状态，包括花柄、花瓣、子房变化情况，统计结实数并计算结实率，公式：

结实率/%=(结实个数/授粉花朵数)×100

1.2.3 蒴果形态特征研究

参考周慧君等[14]方法。授粉140～150d后，摘下未开裂的蒴果，带回实验室，随机选取10个蒴果，测量蒴果的长、宽、果柄长和重并记录，打开果荚取出种子混合，制片9张，每张片子随机选取5个视野，在生物显微镜(4×)下观察并记录种子数量和有胚种子数量，计算种子有胚率。公式：

种子有胚率/%=(有胚种子个数/种子总个数)×100

取部分混合后的种子放入离心管中，加入0.5%TTC染色液，28℃培养12h后，制片9张，每张片子随机选取5个视野，在显微镜(4×)下观察种子染色情况，红色则为有活力种子，计算种子生活力。公式：

种子生活力/%=(有活力的种子数/观察种子总数)×100

1.3 数据处理

试验结果用Excel 2019进行初步整理，用SPSS 26对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 梵净山石斛花期各阶段特性及花部结构测定

梵净山石斛花期可分为花芽萌动期、始蕾期、现蕾期、露色期、始花期、盛花期、末花期7个时期。花芽萌动期约在3月初出现，在节间形成突起的萌动的花芽，见图1a；3月中旬左右，绿色的花蕾开始出现，为始蕾期，见图1b；花蕾出现约7d后，花蕾大面积露出，为现蕾期，见图1c；5d左右后，花柄出现，花蕾颜色进一步加深，为露色期，见图1d；露色期到始花期需要3～9d，之后很快进入盛花期，见图1e、图1f。据观察，种植于贵州省植物园大棚温室的梵净山石斛花期比野外环境下(梵净山)花期提前20d左右，这是由于温度影响，温度高花期会提前。

注：1为中萼片；2为花瓣；3为侧萼片；4为唇瓣。

从表1、图1可知，梵净山石斛花呈橙黄色和黄褐色，萼片和花瓣颜色从里到外逐渐加深，花瓣近椭圆形，中萼片长12.8～18.0mm，宽4.0～5.5mm，花瓣长12.1～17.0mm，宽3.8～6.0mm，子房长21.4～31.0mm，唇瓣外部橙黄色或黄褐色，中部具有一条紫色斑块，边缘白色，合蕊柱长9.2～11.50mm，合蕊柱宽2.2～5.2mm，合蕊柱长1.8～2.9mm，药帽乳白色，花粉块黄色。

表1 梵净山石斛花部结构大小

2.2 梵净山石斛人工授粉研究

梵净山石斛花朵人工授粉后3～4d开始枯萎，7d左右花朵基部开始膨大形成蒴果，则表明授粉成功。由表2可知，梵净山石斛自花授粉和同株异花授粉均不能结实，仅异株异花能成功结实，结实率为43.24%，说明梵净山石斛异交亲和，自交不亲和性。

表2 梵净山石斛人工授粉结实率

表3 蒴果形态特征及种子发育情况

2.3 蒴果形态特征研究

从图2a可知，梵净山石斛授粉成功后，花朵枯萎基部逐渐膨大，从而形成蒴果，膨大期为4月，随后进入生长期，授粉140～150d后，蒴果未开裂时可采摘，此时种子呈粉尘状且可以快速抖落，可用于无菌播种。取授粉140～150d后的蒴果进行形态观察，见图2b，得出蒴果绿色，纺锤形，长2.22～3.12cm，宽0.72～1.24cm，果柄长0.50～3.36cm，单粒蒴果平均重为0.90g；将蒴果切开，观察梵净山石斛种子，见图2c，其为黄色，粉末状，小，数量多。通过生物显微镜观察可知，其种子呈细长船型，两端较窄，中间较宽，胚位于种子中间较宽部分。梵净山石斛种子大部分为有胚种子，无胚种子较少，种子有胚率在82.26%～97.35%，平均种子有胚率为91.73%，通过TTC染色法测定种子活力，得出种子生活力在73.08%～92.66%，平均种子生活力为86.92%，表明人工授粉后的梵净山石斛种子胚发育较好，生活力较强。

注：1为无胚种子；2为有胚种子；3为未被染色的种子；4为被染色的种子。

3 讨论与结论

梵净山石斛花期3—4月，开花进程可分为花芽萌动期、始蕾期、现蕾期、露色期、始花期、盛花期、末花期7个时期。其花具有2种颜色，橙黄色和黄褐色，颜色从里到外逐渐加深，表明其花朵具有较高的观赏性，观赏价值高。花器官中，平均中萼片长15.21mm，宽4.79mm，子房长21.4～31.0mm，平均合蕊柱长10.54mm，合蕊柱宽4.10mm，合蕊柱长2.12mm。

石斛属植物自交亲和性存在差异，可表现为异交亲和，异交和自交都亲和，自交亲和[10]；文献报道，翅萼石斛、棒节石斛、玫瑰石斛、晶帽石斛、黄花石斛、金钗石斛自花授粉、同株异花以及异株异花授粉均能结实，其中玫瑰石斛自花授粉结实率最高[13，16]，表明其均存在自交和异交亲和；梵净山石斛自花授粉和同株异花授粉结实率均为0，只有异花授粉才能授粉成功获得蒴果，表明梵净山石斛存在自交不亲和，异交亲和，与束花石斛[10]、喇叭唇石斛[15]一样。

本试验对人工授粉的蒴果进行种实发育观测，结果表明，梵净山石斛蒴果平均长2.57cm，宽0.92cm，单粒平均0.90g。种子有胚率平均数可达91.73%，平均种子生活力可达86.92%，表明采用人工授粉方式获得的种子胚发育较好，生活力较强，具有一定的萌发能力，适合于作为无菌播种的材料。

研究濒危植物开花物候和繁育系统有利于了解其繁育过程的限制影响因子，从而通过人为干预，促进其保护[17]，因此，繁育特性研究是梵净山石斛保育的重要研究内容，本试验对梵净山石斛开花特性、人工授粉以及蒴果的发育进行了观测，为其保育提供基础资料。