康柏西普结膜下注射对兔小梁切除术后滤过通道内瘢痕形成的影响

孙中华，刘翠娟，张艳，纪珍，刘伟，王建荣，孙嬿，刘明坤，张苗苗

1 济南市第二人民医院眼科，济南 250000；2 曹县人民医院药剂科；3 山东第一医科大学临床与基础医学院

青光眼是一种常见的致盲性眼病，预测至2040年，全球青光眼患者将达到1.1 亿人［1］。目前，小梁切除术仍是治疗青光眼的最常用手术方法。但术区结膜下成纤维细胞过度增殖、胶原沉积可导致滤过泡瘢痕形成，堵塞滤过通道［2］，是导致小梁切除术治疗失败的重要原因。小梁切除术后通常给予丝裂霉素（MMC）、5-氟尿嘧啶（5-FU）来抵抗术后滤过通道的瘢痕化［3-4］。然而，这两种药物与低眼压、薄壁滤泡形成、晚期滤过泡渗漏、包膜囊性滤泡、眼内炎、黄斑水肿等发生风险密切相关［5］。有研究报道，青光眼滤过手术失败患者筋膜组织血管内皮生长因子（VEGF）表达显著升高［6］。VEGF 能够参与滤过通道中成纤维细胞增殖和新生血管化，并促进瘢痕形成［7］。康柏西普是我国自主研发的新一代融合蛋白类抗VEGF 药物，其抗瘢痕效果可能与MMC 类似，还能辅助稳定滤过泡形态和降低术后眼压［8］。2021—2023 年，本研究探讨了康柏西普对兔小梁切除术后滤过通道内瘢痕形成的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年新西兰大白兔40 只，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg，购自济南西岭角生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（鲁）20200004。所有新西兰大白兔于济南市第二人民医院动物实验中心单笼饲养，自由摄食和饮水，饲养条件：温度（22 ±1）℃、湿度（55 ± 5）%，光照12 h/12 h 明暗交替。本研究严格遵循《实验动物管理条例》（2017 修订版）。康柏西普眼用注射液，购自成都康弘生物科技有限公司；注射用丝裂霉素，购自瀚晖制药有限公司；盐酸塞拉嗪注射液，购自吉林省华牧动物保健品有限公司；盐酸丙美卡因滴眼液，购自南京瑞年百斯特制药有限公司。OPMI Lumera®手术显微镜，购自德国Zeiss公司；SL-2G裂隙灯显微镜，购自日本Topcon公司；Eclipse Ci-L 正置显微镜、DS-Ri1-U3 数码显微成像系统，购自日本Nikon 公司；TA01 眼压计，购自芬兰iCare公司。Masson三色染色液，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；Dako REALTMEnVisionTMDetection System，购自武汉Agilent公司）。

1.2 动物分组处理 所有新西兰大白兔适应性喂养1 周后，按随机数字表法随机分为4 组：小梁切除术中联合应用丝裂霉素组（A 组）、小梁切除术毕注射康柏西普组（B 组）、小梁切除术中联合应用丝裂霉素并术毕注射康柏西普组（C 组）、小梁切除术毕注射生理盐水组（D 组），每组10 只。充分缩瞳后，盐酸塞拉嗪0.2 mL/kg 肌内注射麻醉。麻醉完全后，于右眼行标准小梁切除术。A 组术眼板层巩膜瓣剥离后，分别于筋膜囊、巩膜瓣下放置0.4 mg/mL丝裂霉素C棉片2 min，然后生理盐水彻底冲洗；B组术毕于术区滤过泡旁开约3 mm 处结膜下注射康柏西普0.05 mL；C 组术中放置丝裂霉素C 棉片，术毕注射康柏西普，具体步骤参照A、B组；D 组术毕于术区旁开3 mm 处结膜下注射生理盐水0.05 mL。手术均由同一位经验丰富的眼科医师完成。

1.3 眼压测量 术前及术后第1、3、7、14、28 天，盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，采用iCare眼压计测量眼压。

1.4 术眼滤过泡形态观察和并发症观察 每天裂隙灯显微镜下观察术眼滤过泡及其表面血管充血情况，并观察术眼有无感染性眼内炎、滤过泡渗漏、角膜上皮损伤、虹膜粘连等并发症情况。

1.5 术眼滤过泡组织病理观察 术后28 d，采取耳缘静脉空气栓塞法处死，迅速剪取滤过泡区域的结膜、结膜下组织及巩膜、虹膜组织块，大小约5 mm×5 mm。多聚甲醛固定，常规脱水、透明、包埋，5 µm厚连续切片。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，苏木素染色，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，伊红染色，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下拍照观察。每张切片随机选择3 个不重叠的200 倍镜视野，观察滤过通道组织结构。

1.6 滤过通道组织胶原蛋白沉积和纤维化程度观察 将上述石蜡切片脱蜡至水，Masson A 液浸泡过夜，Masson B 液与Masson C 液等比混合染液浸染1 min，1%盐酸乙醇分化，Masson D 液浸染6 min，Masson E液浸染1 min，Masson F液染色2～30 s。切片用1%冰醋酸漂洗分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。每张切片在100 倍镜视野下选取相同视野照相，采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件计算滤过通道内新生胶原纤维面积在整个切片中结膜和巩膜空间总面积的占比。

1.7 滤过通道组织CD31 表达检测 取术眼滤过泡组织，常规制备石蜡切片。切好经60 ℃烤箱烤片3 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，微波加热抗原修复，自然冷却至室温，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。山羊血清室温封闭30 min，滴加经稀释的CD31 一抗，4 ℃湿盒中孵育过夜。次日，滴加HRP 标记的山羊抗兔/小鼠二抗，37 ℃孵育30min。DAB 显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。采用Eclipse Ci-L 正置显微镜选取目标区域200 倍拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 软件分析。每张切片随机选择3 个200 倍镜下视野，计数CD31 阳性表达的微血管数量，以3 个视野下CD31 阳性表达微血管数的平均值作为MVD。

1.8 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料经Shapiro-Wilk 检验符合正态分布，以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组手术前后眼压比较 各组眼压于术后第3 天降至最低，术后第7 天逐渐回升，术后第28 天几乎完全恢复至术前水平，见表1。

表1 各组手术前后眼压比较（mmHg，± s）

表1 各组手术前后眼压比较（mmHg，± s）

注：与同组术前比较，*P＜0.05；与同组术后第1天比较，#P＜0.05；与同组术后第3天比较，▲P＜0.05；与同组术后第7天比较，▼P＜0.05；与同组术后第14天比较，△P＜0.05；与A组同时间比较，▽P＜0.05。

组别A组B组C组D组F P n 10 10 10 10眼压术前15.01 ± 1.56 15.27 ± 2.04 14.98 ± 1.45 15.13 ± 2.15 0.052＞0.05术后第1天12.33 ± 2.21*12.01 ± 1.28*12.54 ± 2.01*11.98 ± 1.84*0.207＞0.05术后第3天7.79 ± 1.38*#9.77 ± 1.78*#8.24 ± 1.56*#8.76 ± 2.00*#2.519＞0.05术后第7天8.13 ± 2.00*#10.44 ± 2.19*▽9.21 ± 1.79*#10.17 ± 1.36*3.170＜0.05术后第14天11.50 ± 2.51*▲▼12.75 ± 1.67*▲11.97 ± 1.82*▲▼12.35 ± 1.58*▲0.765＞0.05术后第28天15.02 ± 1.86#▲▼△14.99 ± 2.13#▲▼15.19 ± 2.22#▲▼△14.87 ± 2.14#▲▼△0.040＞0.05

2.2 各组术后滤过泡形态观察及其并发症情况 术后第7 天，A、B、C 组术区均形成功能性滤过泡，D 组滤泡表面结膜血管密集，血管化明显，滤过泡区域扁平。其中，A 组滤泡高度升高，表面血管稀疏；B 组滤泡弥漫性升高，滤泡表面未见明显充血；C 组滤泡弥漫性升高，滤泡表面及结膜表面未见明显充血。随着时间延长，至术后第28 天，各组术区结膜均逐渐充血减轻消退，滤过泡局限、扁平。

各组观察期间均未发生明显角膜上皮损伤相关并发症，A 组术后第14天发生滤泡漏致眼内炎1例，术后第28 天发生薄壁滤泡形成1 例、术区前粘连1例，B、C、D组均未发生明显并发症。

2.3 各组滤过泡组织病理学和CD31阳性观察 术后第28 天，A、B 组术眼组织病理学特征相似，均可见疏松的胶原纤维排列及局部增厚的上皮组织，伴有淋巴细胞点状浸润；A、C 组均可见到虹膜中较多上皮细胞变性，细胞肿胀，胞质空泡化，而B 组未见到此类病理改变。

术后第28 天，A 组可见滤过通道周围组织中少量CD31阳性细胞及新生血管增生；B 组可见滤过通道周围组织中少量CD31 阳性细胞，较少的新生血管增生；C 组亦可见滤过通道周围组织中少量CD31阳性细胞及新生血管增生，与A 组相似；D 组可见较明显的滤过通道周围组织中CD31 阳性细胞及新生血管增生。各组滤过泡组织胶原纤维占比和微血管计数比较见表2。

表2 各组滤过泡组织胶原纤维占比和微血管计数比较（± s）

表2 各组滤过泡组织胶原纤维占比和微血管计数比较（± s）

注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05。

组别A组B组C组D组F P n 10 10 10 10胶原纤维占比（%）47.26 ± 11.98 33.63 ± 3.45*48.28 ± 2.64#92.92 ± 1.92*#△64.123＜0.05微血管计数（/HP）12.17 ± 3.20 5.17 ± 1.04*13.13 ± 3.11#14.40 ± 3.42#8.317＜0.05

3 讨论

小梁切除术是目前治疗青光眼的主要手术方式。随着时间推移，小梁切除术后滤过通道内瘢痕形成和滤过通道过度愈合导致眼压失控，是导致治疗失败的重要原因。因此，小梁切除术后通常给予MMC、5-FU 来抵抗术后滤过通道瘢痕化［3-4］，提高手术成功率。然而，临床研究发现这些药物在抑制滤过通道瘢痕化的同时可增加并发症的发生风险。因此，临床亟需寻找一种青光眼小梁切除术后安全、有效的抗瘢痕治疗方法。

VEGF 是新生血管形成的关键因素，在伤口炎症和纤维化的过程中起重要作用。研究表明，青光眼滤过手术失败患者筋膜组织VEGF 表达增加［6］。青光眼滤过术后第3 天术区VEGF 表达开始上升，术后至少7 天内保持在一个较高水平，术后第13 天开始下降，术后3 周后恢复正常［9］。抗VEGF 药物对治疗新生血管性青光眼具有较好效果［10］。然而，在探索青光眼滤过手术后滤过通路内抗瘢痕形成中，多数研究集中在贝伐单抗（BVZ）上。BVZ 是一种重组人源性单克隆抗体，可抑制肿瘤中新生血管形成，其在肿瘤中的应用剂量较大，而在眼科中抗新生血管形成的应用剂量较小，因而BVZ 并不适合在眼科中应用。康柏西普是一种抗血管内皮生长因子的融合蛋白，具有双重作用机制，其关键区域由人VEGFR1的第2个Ig结构域、VEGFR2的第三和第四个Ig结构域以及人IgG1的恒定Fc区域组成，VEGFR1与VEGF-A、VEGF-B和PIGF结合，VEGFR2与VEGF-A结合，从而阻断VEGF-A、VEGF-B 和PIGF 的所有亚型，能够有效抑制新生血管形成并促进新生血管消退。康柏西普在治疗年龄相关性黄斑变性、病理性近视继发的脉络膜新生血管和糖尿病性黄斑水肿等的有效性和安全性已得到临床证实。在少数关于康柏西普对抗青光眼术后抗瘢痕形成作用的研究中，仅观察了其在青光眼患者术后抗瘢痕治疗的有效性［11］。因此，本研究试图通过建立兔小梁切除手术模型，从组织病理学和免疫组化方面探讨康柏西普对小梁切除术中抗瘢痕及抗新生血管形成的有效性和安全性。

本研究结果发现，各组眼压于术后第3 天降至最低，术后第7天逐渐回升，术后第28天几乎完全恢复至术前水平。但除B 组术后第7 天外，各组间眼压比较差异均无统计学意义。这是因为本研究为正常眼压模型，行小梁切除手术造成的瘢痕化对眼压波动的影响较小。因此，兔眼眼压波动不能作为判断滤过通道瘢痕形成和有效滤过的指标。

在术眼滤过泡形态和组织病理方面发现，术后第7 天，除D 组外，其他三组术区均形成良好的弥漫性隆起滤泡组织且表面血管稀疏。随着时间延长，至术后第28 天，各组术区结膜均逐渐充血减轻消退，滤过泡局限、扁平，表明瘢痕逐渐形成。术后第28 天，A、B 组术眼组织病理学特征相似，均出现局部上皮增厚，轻度基质水肿，胶原纤维排列松散，少量淋巴细胞点状浸润；A、C 组均可见到虹膜中较多上皮细胞变性，细胞肿胀，胞质空泡化，而B 组未见到此类病理改变。提示丝裂霉素、康柏西普联合抑制滤过通道瘢痕形成和新生血管形成。

本研究结果发现，术后第28 天，A、B、C 组滤过通道胶原纤维占比均低于D组，并且B组滤过通道胶原纤维占比低于A、C组；B组滤过通道组织中微血管数目明显低于A、C、D 组。进一步证实，康柏西普能够抑制滤过通道纤维化、阻止新生血管和瘢痕形成，与以往研究［11-12］报道一致。虽然康柏西普显示出类似抗代谢药物的抗纤维化和抗血管化作用，但与丝裂霉素联合并没有观察到抗瘢痕形成效果优于单独用药。既往研究同样发现，青光眼术后给予BVZ+5-FU或单独使用5-FU 治疗，在视力、术后眼压和抗青光眼药物的使用方面比较差异无统计学意义［13］。LIANG 等［14］同样观察到青光眼术后第14 天BVZ 注射后滤过通道中胶原纤维沉积和血管化水平低于丝裂霉素治疗。因此，抗VEGF 药物和抗代谢药物联合使用是否能达到“1+1＞2”的抗瘢痕作用仍存在争议。抗代谢药物的使用是否因增加VEGF 的表达水平将抵消部分抗VEGF 药物对血管和胶原纤维生产的抑制作用，以及抗VEGF 药物单独应用是否优于抗代谢药物单独应用或药物组合应用仍需进一步研究。

本研究发现，A 组术后发生薄壁滤泡形成1 例、术区前粘连1 例、滤泡漏致眼内炎1 例，B、C、D 组均未发生明显并发症。病理结果显示，B、C 组兔眼虹膜组织均出现上皮细胞变性、细胞肿胀和胞质空泡化。结果提示，抗VEGF 药物可能具有更高的安全性。与静脉注射相比，结膜下给药途径引起药物全身吸收较少，故选择结膜下注射作为康柏西普的给药途径具有更高的安全性。

综上所述，康柏西普结膜下注射能抑制兔小梁切除术后滤过通道新生血管形成和瘢痕化，辅助维持滤过泡形态，从而有效提高青光眼小梁切除术成功率。