高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度的分析与研究

苏洪涛,蓝 妮

(厦门大学附属第一医院,福建 厦门 361000)

万古霉素是一种广谱抗生素,常用于治疗多种感染疾病,为了确保该药物的疗效和安全性,需要进行血药浓度监测[1]。HPLC被广泛应用于万古霉素血药浓度的分析与研究[2]。HPLC是一种常用的分离和定量分析技术,HPLC基本原理是将待测样品通过一个固定填充物的柱子进行分离。样品溶解于流动相中,并由一液体泵推动流经柱子的流动相。在柱子内部存在着一种固定的填充物,称为固定相[3]。样品中的组分会根据其与固定相的亲疏水性质的不同以及其他化学相互作用的差异,在流动相的作用下分离出来。分离出的各个组分可通过检测器进行监测和定量。HPLC中的流动相通常为有机溶剂和水的混合物,根据样品的性质和分离要求进行选择和调节,流动相的选择对分离效果和分析速度有重要影响[4]。进样器用于将待测样品精确地引入流动相中,常见的进样方式包括手动进样和自动进样系统。柱子是HPLC的核心组件,也称为色谱柱或固定相柱,柱子内部填充有具有特定吸附性质的颗粒状材料,如硅胶、碳氢化合物、反相材料等,不同的柱子和填充物适用于不同的分离类型。检测器用于检测样品在柱子中分离过程中的化学或物理性质的变化,常见的检测器包括紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、电化学检测器等[5]。数据系统用于采集、处理和分析检测器得到的数据,通过数据系统可以实现峰面积的计算、峰识别和结果输出等功能。HPLC技术具有高分辨率、高灵敏度、高重复性等优点,能够同时分析多种组分,且可用于定量分析和结构鉴定[6]。本文采用去甲基万古霉素作为内标,对万古霉素血药浓度进行了检测,结果准确、简便,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试药

岛津高效液相色谱仪:LC-20AB泵,SIL-20A型全自动进样器,CTO-20A型色谱柱,SPD-20AV型紫外线检测器,DGU-20A3型在线脱气装置,LC-解决方案工作站;Millipore Simplicity纯水仪;Eppendorff Centrifuge 5804R低温高速离心机;AL 104-IC电子天平;XH-B型漩涡混合器。

万古霉素对照品,去甲万古霉素对照品,色谱纯为乙腈,分析纯为磷酸二氢钾及磷酸,水为Millipore水仪制得的超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱:依利特Hypersil BDSC8(4.6mm×250mm,5μm),40℃柱温;流动相:20 mmol磷酸二氢钾,pH值调节到3.1;采用梯度洗脱,条件如下:0～6.5min,B为乙腈,从10%下降到5%;6.5～6.51 min,B为50%;10.0～10.01min,B由5%上升到10%,10.01～17.5 min,B为10%。流速1.0 mL/min;检测波长236 nm;进样量20μL内标法定量。

1.2.2 流动相的配制

精确称取1.361 g磷酸二氢钾,将其溶于500 mL超纯水中,再添加100 μL磷酸,在溶解和均匀混合之后,用0.45μm的水相滤膜进行过滤,得到pH为3.1的20 mmol/L的磷酸二氢钾溶液。

1.2.3 储备液的配制

对照品储备液:取10 mL容量瓶,准确称量适当数量的万古霉素参照物,以超纯水溶解,定容后得万古霉素参照物1.05 mg/mL;将1mL的溶液置于10mL的容量瓶内,用超纯水稀释至刻度后,经充分搅拌后,得105mL的标准溶液,于4℃冷藏保存。

内标工作液:精确称取去甲万古霉素对照品适量,将其放入25 mL的容量瓶中,以超纯水溶于定容,搅拌均匀,制成200 mg/L的内标液。并在4℃下冷藏。

1.2.4 血样处理

取血浆样品0.4 mL,放入2.0 mL的离心管内,加入25 μL的内标液,搅拌均匀后,加入乙腈0.8 mL,漩涡振动3min,14000 r/min的离心8min,再将1 mL的上清液放入玻璃试管,再加二氯甲烷3 mL,漩涡振动3min,3000 r/min的离心6min,再将20 mL的上清液放入样品。定量采用内标法。

2 结果

2.1 线性关系考察

取一份空白血浆,并精确地添加不同量的万古霉素对照品储备液,使血浆中的药物浓度分别为1.313、2.625、5.25、10.5、26.25、52.5、105 mg/L,按照血样进行处理,以被测物峰面积与内标峰面积的比值Y对X(mg/L)进行线性回归,权重为1/X。得回归方程为:Y=0.0620X+0.1020,r=0.9990。本实验的线性范围为1.310～105.00 mg/L,最低检测浓度(S/N≥3)为0.658 mg/L。

2.2 方法的专属性考察

采用不同的样品前处理方式及层析分离条件,分别测定了空白血浆、内标物及对照品及内标物的层析图谱。在万古霉素的出峰位置,去甲万古素的出峰位置,没有显著杂质干扰,内标万古霉素保留时间为4.65min,去甲万古素的保留时间为5.55min。

2.3 回收率试验

绝对回收率:精密抽取对照品储备液,配制出浓度为5.25、26.25、78.75 mg/L的含药血浆各5份,按照血样进行处理进样,将两者峰面积进行记录,并将其与相应浓度对照品峰面积进行对比,得出绝对回收率,3种浓度血浆样品的绝对回收率(n=5)分别为66.58%、70.51%、69.79%,去甲万古的回收率(n=5)为73.88%。

方法回收率:将三种浓度分别配制成5.25、26.25、78.75 mg/L的含药血浆,每一种浓度分别为5份,将其作为血液样品进行处理,然后进样,对其浓度进行测定,并对其进行计算,从而计算出检出量与添加量的比值,从而得到方法的回收率。见表1。

表1 相对回收率与精密度

2.4 精密度试验

配制出5.25、26.25、78.75 mg/L三种浓度的含药血浆,各5份,将其作为血液样品进行处理,在同一天进行测量,并连续测量4天,计算出日内和日间的精密度。见表1。

3 讨论

万古霉素是一种广谱抗生素,属于糖肽类抗生素,它是一种通过抑制细菌细胞壁合成而发挥作用的药物[7]。万古霉素主要用于治疗由对其他抗生素耐药的细菌引起的感染,万古霉素可通过静脉注射或静脉滴注进行给药,通常在医院的严密监测下使用[8]。万古霉素的副作用相对较少,但仍可能出现一些不良反应,包括过敏反应、红斑性瘙痒病、肾功能损伤等。此外,长期使用万古霉素可能导致肠道菌群失调,增加耐药菌感染的风险。在使用万古霉素之前,应该先进行细菌敏感性测试,以确定细菌对该药物的敏感性,此外,患者需要定期进行肝功能和肾功能的监测,以确保安全使用。HPLC是一种精准、灵敏且可靠的分析技术,常用于药物血药浓度的测定,在万古霉素的分析中,HPLC能够有效地分离和定量目标药物,并且具有较高的分析速度和准确性[9]。在进行万古霉素血药浓度的HPLC分析之前,需要对血液样品进行适当的制备,通常采用蛋白沉淀、提取等方法将万古霉素从血液中分离出来,然后使用合适的溶剂进行稀释和洗脱以得到待测样品。为了实现准确的血药浓度测定,需要建立万古霉素的标准校准曲线,绘制得到校准曲线,并根据曲线计算样品中万古霉素的浓度[10]。此外,还需要在分析过程中加入质控样品进行质量控制,以确保分析结果的准确性和可靠性。

HPLC可以检测非常低的浓度,能够确定万古霉素在血液中的浓度;HPLC能够通过优化分离柱和流动相的条件,实现对万古霉素与其他组分的有效分离,从而避免干扰物质对测定结果的影响;HPLC具有良好的定量能力和可重复性,能够提供准确的万古霉素浓度数据;HPLC是一种高效的分析方法,能够在较短的时间内完成样品的分离和测定,提高工作效率;HPLC可以根据需要选择不同类型的柱和检测方式,适应不同样品类型和分析要求,使其具有很大的灵活性[11-12]。综上所述,HPLC作为一种高灵敏度、高选择性、高精确度和重复性的分析技术,是测定万古霉素血药浓度的理想方法之一。本文研究结果显示,本测定法在1.310～105.00 mg/L有较好线性关系(r=0.9990),日内、日间精密度均≤5.21%,绝对回收率>66%。

综上所述,HPLC法检测血液中万古霉素的含量,具有快速、可靠、结果准确等优点。