胰腺星状细胞活化参与慢性胰腺炎的转录调控研究进展

黄邦伟,王鹏源,胡良皞

黄邦伟,王鹏源,胡良皞,海军军医大学第一附属医院消化内科 上海市 200433

王鹏源,联勤保障部队第九八一医院消化内科 河北省承德市 067000

0 引言

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是胰腺进行性、不可逆的纤维炎性综合征,最终导致胰腺内外功能损伤.在中国、印度和日本,CP患病率约为36-125/10万人,目前全球CP患者预计超过700万人,并且呈逐年上升趋势[1].CP的主要病理特征包括腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润、胰腺纤维化等,其中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白沉积引起的进行性胰腺纤维化是CP的特征性病理变化[2].

在肝脏纤维化发生的过程中,活化的肝脏星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肌成纤维细胞的主要来源.与肝脏类似,胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSC)活化是参与CP胰腺纤维化的重要事件,在纤维化发生发展中扮演重要角色[3].在PSC活化参与胰腺纤维化及CP发生、发展过程中,多种信号通路[如转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、JAK-STAT、Wnt、Hedgehog等]、转录因子参与了PSC的活化及纤维化进程.本文就PSC活化参与CP胰腺纤维化的TGF-β信号通路和转录因子进行述评,并针对靶向TGF-β治疗CP的研究进展进行分析.

1 PSC活化在CP胰腺纤维化中扮演重要角色

纤维化是器官实质细胞坏死和ECM过度沉积,导致结缔组织增生,甚至产生器官硬化的病理过程,如肝硬化、心肌纤维化以及胰腺纤维化等,通常是组织损伤的终末阶段.器官纤维化导致的死亡占工业化世界死亡率的45%[4].组织纤维化通常伴随着成纤维细胞增殖和活化,成纤维细胞是高度动态的细胞,纤维化进程中成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,在组织修复和纤维化中起核心作用.

胰腺纤维化是CP最具特征性的病理表现,PSC作为成纤维细胞在CP胰腺纤维化中扮演重要角色.在正常胰腺组织中,PSC处于静止状态,分布于腺泡周围和小叶间隙,可能与维持腺泡细胞的正常结构和功能有关[5].然而在胰腺损伤过程中,各种刺激因子可激活PSC并向肌成纤维细胞转化,肌成纤维细胞高表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),并分泌大量ECM,包括Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白等,过量的ECM沉积在损伤的胰腺组织中,从而出现胰腺纤维化,影响胰腺组织的正常功能[6].活化的PSC表现出很强的增殖和迁移能力,通过影响能量代谢、细胞死亡和氧化应激等途径参与胰腺纤维化[7],研究证明TGF-β为代表的多种信号通路参与这一过程.

2 TGF-β及其介导的经典Smad信号通路在胰腺纤维化调控中发挥重要作用

2.1 TGF-β1是最强的促纤维化细胞因子 TGF-β是一种具有多种功能的细胞因子,发挥多种生物学功能,包括调控细胞增殖和分化、细胞凋亡、免疫反应、组织修复等过程[8].TGF-β由细胞内具备激酶结构域的TβR Ⅱ受体识别,该结构域招募并磷酸化TβR Ⅰ受体,从而使TβR Ⅱ和TβR I形成复合物.此外,TGF-β1还是最强的促纤维化细胞因子之一,通过自分泌或旁分泌的方式调控成纤维细胞的活[9].TGF-β1和PSC之间构成一个自分泌刺激环路.活化的PSC可产生TGF-β1,与PSC受体结合后可启动其下游信号传导,加速PSC的激活,因此TGF-β1也被称为PSC的激活剂.除此之外,损伤的腺泡细胞也是TGF-β1的重要来源.在萎缩的腺泡细胞内发现TGF-β1表达明显升高,损伤的腺泡细胞可通过旁分泌TGF-β1的形式介导PSC的活化[10].总之,TGF-β通过旁分泌和自分泌的方式促进PSC活化和ECM的沉积,在胰腺纤维化的发生发展中起着至关重要的作用.

2.2 TGF-β介导的纤维化信号通路分为经典的Smad信号通路和非Smad信号通路

2.2.1 经典的TGF-β/Smad信号通路:经典的TGF-β/Smad信号通路在器官纤维化中起重要作用[11]:其中Smad是TGF-β信号通路中的关键转录因子[12].不同的Smad转录因子可能发挥不同的作用.活化的TβR I可磷酸化Smad2和/或Smad3蛋白,并与Smad4结合形成异三聚体复合物.Smad2/3/4复合物作为转录因子进入细胞核中,促进纤维化相关基因的表达[13].而Smad7是TGF-β介导的胰腺纤维化的负性调控因子,Smad7在胰腺中的过表达能够显著抑制雨蛙素诱导的胰腺纤维化[14].

Smad能直接调控PSC的活化促进胰腺纤维化.有研究发现Smad6在CP小鼠胰腺组织中明显增加,在新鲜分离的PSC中过表达Smad6和Smad7可显著降低α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA水平[15].白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)在活化的PSC和CP组织中增加,而研究报道IL-6是通过上调TGF-β1/Smad2/3途径来促进PSC的活化[16].TGF-β1/Smad通路还与PSC的增殖和迁移相关.过表达半乳糖凝集素(galectin-1)通过促进TGF-β1/Smad通路来降低基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases1,MMP)/基质金属蛋白酶组织抑制剂(matrix metalloproteinases tissue inhibitors,TIMP)的比例,从而促进PSC的增殖和迁移[17].

2.2.2 非Smad通路:非Smad通路包括丝裂活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路、Janus激酶信号转导和转录激活因子(janus activating kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)等信号通路.非Smad信号通路与Smad信号通路共同促进胰腺纤维化的发生.

MAPK家族的三种激酶(JNK1/2、ERK1/2和p38)与CP胰腺纤维化关系密切[18].在活化的PSC中加入ERK抑制剂,可显著降低PSC中炎症趋化因子受体和α-SMA的表达.JNK在TGF-β等细胞因子作用下,被MAPK磷酸化后激活.研究报道中药复方柴胡桂枝干姜汤通过促进JNK 磷酸化,并激活JNK/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路抑制PSC自噬从而抑制PSC的活化并缓解胰腺纤维化.此外,p38是一种应激活化蛋白激酶,可被多种细胞因子激活,参与细胞凋亡、转录调控等过程.应用p38特异性抑制剂处理新鲜分离的小鼠PSC后,可显著降低PSC中α-SMA和Ⅰ型胶原的水平[19].由此可见TGF-β信号通路通过经典的TGF-β/Smad信号通路和非Smad信号通路在CP胰腺纤维化中发挥着至关重要的作用.

2.3 靶向TGF-β及其相关信号通路治疗CP胰腺纤维化的策略 进入21世纪,精准医学得到了长足的发展,其中靶向治疗是最有前途的一种治疗方式.大量证据表明,靶向TGF-β及其相关信号通路具有治疗纤维化的潜力.目前TGF-β靶向药物主要分为中和抗体、小分子TGF-β抑制剂、生物制药、siRNA等[20].

如上所述,TGF-β信号通路的异常激活在CP纤维化发挥着重要作用,因此靶向TGF-β及其下游通路有望在未来开发出治疗CP胰腺纤维化的药物.SB-431542是一种抑制TGF-βRI磷酸化的化合物,SB431542可显著下调血清淀粉酶、IL-6和TGF-β水平,并可减弱雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型胰腺组织病理改变,表明SB431542对急性胰腺炎具有保护作用.急性胰腺炎反复发作可进展为CP,因此SB431542对CP胰腺纤维化是否也具有保护作用值得进一步研究.Galunisertib(LY2157299)和SD-093是一种可特异性下调Smad2/3磷酸化程度的TGF-βRI激酶抑制剂,能显著抑制胰腺癌细胞的活性和侵袭能力[21,22].然而这种靶向TGFβRI激活的药物并没有在CP纤维化中进行研究.但是,抑制TGF-β下游信号传导来缓解CP胰腺纤维化是一种可行的策略.

由于TGF-β可调节多种信号通路以及胰腺纤维化的复杂性,靶向TGF-β及下游分子的策略在纤维化患者中的应用具有挑战性.一些天然产物,如大黄素和绿茶多酚,可降低CP动物模型中TGF-β的水平,能够有效缓解CP纤维化水平.天然化合物有望在未来成为缓解CP胰腺纤维化的新型药物之一[23].另外,生物制药产品拥有药代清晰、非靶效应少的优势,小RNA药物能够靶向一些难以成药的靶点,在胰腺纤维化药物研发中也有广阔的前景.但我们需要认清的是,目前胰腺纤维化研究远没有其他纤维化疾病,如肝脏纤维化、心肌纤维化等广泛且深入,也没有针对明确靶点的相关药物进行临床研究,与患者的需求还存在很大的差距.

3 其他转录因子与胰腺纤维化

3.1 缺氧诱导因子-1α 缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是一种异二聚体转录因子,在细胞和组织应对缺氧环境下的适应性反应中起关键作用,由HIF α亚基和HIF-β亚基组成.在哺乳动物中,HIF-α亚基具有三种亚型(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α).HIF-1α是细胞适应缺氧环境中的关键转录因子,对维持哺乳动物细胞适应缺氧状态尤为重要.由于胰腺纤维化导致致密纤维结缔组织的形成和血管重塑,胰腺微环境处于缺血缺氧状态,因此HIF在CP胰腺纤维化中也发挥出独特的作用.最新研究发现HIF-1α和HIF-2α在CP组织中升高,HIF-1α和HIF-2α可以在缺氧条件下促进腺泡细胞的鞘氨醇激酶1表达,进而通过调节鞘氨醇激酶1受体/AMPK/mTOR通路促进PSC的活化,促进胰腺纤维化[24].

3.2 核因子κB 核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一种以二聚体形式存在的核转录因子,在炎症和免疫应答中发挥着重要作用[25].NF-κB信号通路是由细胞外的刺激引起的,常见的炎症因子(包括TGF-β和肿瘤坏死因子-α等)都可以激活NF-κB.这些细胞外因子与细胞膜上的受体结合后活化IκB激酶(IκB,kinase,IKK).IKK可将细胞内的NF-κB/IκB复合物上的IκB亚基磷酸化,进而使IκB亚基泛素化修饰,使IκB被降解,从而释放NF-κB转录因子.NF-κB可进入核内,调节炎症相关基因的转录.p65是NF-κB异二聚体的主要形式,p65含有一个Rel同源结构域,负责与DNA结合[26].

在CP胰腺纤维化中,NF-κB信号通路也起着重要作用.Huang等[27]发现小鼠腺泡细胞中NF-κB信号通路的激活与急性胰腺炎的严重程度相关,长期激活可导致胰腺纤维化.该研究报道CP小鼠和活化的PSC中NF-κB水平升高,使用NF-κB抑制剂雷公藤甲素抑制NF-κB信号通路可抑制PSC的活化[27].另一项研究发现P65 siRNA抑制NF-κB表达后,PSC活化水平显著降低,并且TGF-β1对MMP1的抑制作用减弱,而TIMP1的升高被抑制.这些结果表明,NF-κB激活可导致PSC中MMP-1和TIMP-1表达失衡,进而导致ECM沉积及胰腺纤维化[28].

3.3 Bmal1 Bmal1(brain and muscle ARNT-like-1)是生物钟相关基因转录的核心转录因子,能够与昼夜自发输出周期蛋白(circadian locomoter output cycles kaput,CLOCK)形成异二聚体.胰腺生物钟在CP病程中发挥关键作用,而Bmall1是促进胰腺纤维化的关键转录因子.在Bmal1基因敲除的小鼠中胰腺纤维化加重,研究证实腺泡Bmal1缺失不直接影响腺泡细胞,而是通过促进PSC活化加重胰腺纤维化.进一步发现Bmal1蛋白是一种转录因子,可与人类和小鼠基因组的E钙粘着蛋白/上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin,E-cad)启动子中两个E-box序列结合[29].

3.4 转录因子激活蛋白1 转录因子激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)作为启动基因转录的分子开关,参与增殖、分化、凋亡、转化等多种细胞过程[30],是纤维化信号通路的重要下游转录因子,在心脏、肺、肝纤维化发展中发挥重要作用[31].纤维调素(fibromodulin,FMOD)对纤维化疾病具有重要意义,FMOD表达上调可促进HSC活化、增殖、迁移,从而诱导肝纤维化的发生[32].另外AP-1也是胰腺纤维化的重要调节因子,而FMOD在CP胰腺组织中表达升高.An等[33]的研究首次揭示了AP-1和FMOD在胰腺纤维化中的重要作用,过表达AP-1可以上调FMOD蛋白表达.AP-1可以通过结合FMOD启动子促进其转录来激活PSC,促进PSC增殖和迁移,以及胰腺纤维化的发展.

3.5 核因子E2相关因子2 核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一种调节氧化应激的转录因子,是调控机体发挥抗氧化反应的重要防御因子.Kelch样ECH-辅助蛋白-1(kelch-like ECH-assiotiated protein-1,Keap1)是介导Nrf2转移与降解的重要蛋白.在氧化应激条件下,Keap1与Nrf2结合从而发生构象改变,Nrf2磷酸化后和Keap1解离,异位到细胞核,进而与抗氧化反应的基因结合,从而发挥抗氧化作用[34].氧化应激介导PSC活化,并在胰腺纤维化中发挥重要作用,研究发现Nrf2激动剂可抑制PSC的激活[35].同样Nrf2也可以抑制HSC的激活,Nrf2缺失的HSC氧化应激水平升高、活性氧表达升高以及抗氧化能力下降[36].

4 结论

胰腺纤维化的转录调控是涉及多通路、多细胞参与的复杂过程,目前的研究仍以单一细胞和单通路为主,因此我们仍然没有足够的信息来解释在不同细胞甚至在整个胰腺微环境中是否存在一致的调控机制,需要进行更深入的研究.活化的PSC在CP胰腺纤维化中固然扮演重要角色,大部分CP胰腺纤维化的研究也都是围绕PSC进行,然而巨噬细胞、胰腺导管细胞甚至内分泌细胞以及这些细胞和腺泡细胞、PSC之间的相互作用在胰腺纤维化也非常重要,只有全面了解这些细胞间的相互作用及相关信号通路调控网络,才有可能找到控制胰腺纤维化的总开关,并针对相关靶点进行药物研究,从根本上缓解CP患者的痛苦.