昆布多糖WLP5对MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用

曹明原，李 莹，綦国红，杨志萍，黄德春，陈贵堂

（中国药科大学工学院，国家中药材加工技术研发专业中心，江苏 南京 211198）

癌症是导致工业化国家发病率和死亡率升高的主要原因，也是造成人类死亡的主要元凶，其中，乳腺癌在所有癌症中致死率居第二，主要发生在女性身上，其发病率与死亡率预计在未来几年将显著增加[1-2]。目前乳腺癌的治疗方法包括手术切除、内分泌治疗、化疗与放射治疗等[3]，这些治疗方法都可能对患者造成不良的影响，许多化疗药物会导致癌症患者白细胞数量减少并出现疼痛、恶心及食欲不振等症状[4]。所以，从食品或药食同源产品中开发低毒高效的天然活性物质替代药物治疗癌症，是当今医学领域研究的热点与关键。近年来，癌症免疫治疗已成为治疗各种癌症的最佳方法之一，免疫治疗主要是通过刺激或增强人体免疫系统来对抗癌症[5]。大量研究表明，多糖作为一种天然活性成分，有着调节免疫[6]、抗氧化[7]、抗肿瘤[8]及抗病毒[9]等作用，是低毒的生物反应调节剂，常用于辅助治疗，也是用于肿瘤免疫治疗的理想选择。

昆布是褐藻门海带目海带科植物海带（Laminaria japonicaAresch）或翅藻科植物昆布（Ecklonia kuromeOkam）的干燥叶状体，在我国山东半岛、福建及浙江等沿海地区有着广泛分布[10]。昆布在《千金方》《吴普本草》及《中华药典》中均有收录记载，在传统药方中常用于清肠排毒、除湿去肿及改善热结便秘等[11]。此外，昆布作为一种药食两用物质，还具有极高的营养价值，研究表明昆布含有丰富的氨基酸、藻胶酸、多糖、甘露醇及蛋白质等成分[12]，其中昆布多糖作为昆布的主要活性成分之一，与昆布的多种生物活性如抗菌、免疫调节、降血糖及抗肿瘤等作用有关[13-16]。虽然关于昆布多糖的抗肿瘤活性已有大量研究，但到目前为止，关于昆布多糖对MCF-7乳腺癌细胞作用的相关报道较少，其对乳腺癌作用的体内研究也较为缺乏。本课题组前期通过对3 种不同提取方式（热水浸提、超声辅助及复合酶提取）得到的多糖进行分离纯化和抗肿瘤活性筛选，发现热水浸提的昆布多糖WLP5对MCF-7肿瘤细胞有较高的抑制率[10]。通过体外抗肿瘤实验发现，WLP5可通过上调MCF-7细胞中p53和Bax蛋白的表达、促进Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的分泌来抑制肿瘤细胞的迁移，并促进肿瘤细胞凋亡[10,17]。然而，单一的体外实验不足以全面反映昆布多糖的抗肿瘤活性，需要进行进一步的体内实验。因此，在前期工作的基础上，本研究通过建立MCF-7乳腺癌裸鼠模型，进一步研究昆布多糖WLP5的体内抗肿瘤活性及免疫调节作用，以期为抗肿瘤药物的开发及临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

MCF-7人乳腺癌细胞由中国药科大学食品质量与安全实验室传代保存；SPF级裸鼠40 只，雌性，18～22 g，购于常州卡文斯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010）；所有动物实验操作均符合中国药科大学实验动物护理和使用指南（中国药科大学实验动物护理伦理委员会许可证号：SYXK-2018-0019）。

中性树胶、无水乙醇（分析纯）、二甲苯 国药集团化学试剂有限公司；苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染液、分化液、返蓝液 武汉赛维尔生物科技有限公司；盐酸阿霉素（药用级） 北京博奥拓达科技有限公司；白细胞介素-2（interleukin 2，IL-2）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、转化生长因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒 武汉华美生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机、JB-L5冻台 武汉俊杰电子有限公司；RM2016病理切片机 德国徕卡仪器有限公司；KD-P组织摊片机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；GFL-230烤箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；载玻片 武汉赛维尔生物科技有限公司；Eclipse E100显微镜、DS-U3成像系统 日本尼康有限公司；RT-6100酶标仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 昆布多糖分离纯化

昆布多糖WLP5由本课题组前期分离纯化得到[10]。昆布粉用热水浸提（85 ℃、液料比80∶1（V/m）、提取5 h）后离心得到上清液，Sevag法除去蛋白质后用无水乙醇醇沉，之后多次以乙醇、丙酮洗涤后真空干燥得到昆布粗多糖CWLP。WLP5为CWLP经DEAE-52纤维素层析柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析柱洗脱、透析纯化后的昆布多糖组分。WLP5纯度为（89.53±1.34）%，分子质量为14 466 Da，硫酸基相对含量为（3.465±0.004）%，糖醛酸相对含量为（32.642±0.001）%，糖链主要组成单糖为吡喃糖，由α-半缩醛羟基和β-半缩醛羟基两种糖苷键连接，以β-糖苷键为主。前期体外抗肿瘤实验表明WLP5对MCF-7细胞有较好的抑制作用[17]，抑制率优于其他组分，因此，该组分被用于后续动物实验。

1.3.2 荷瘤裸鼠模型的建立

选用体质量在18～22 g的SPF级裸鼠，在无病原体的环境中饲养，将2×106个MCF-7细胞皮下注射到裸鼠的腋窝下构建荷瘤裸鼠模型，至肿瘤体积为约40 mm3时（约4 周）开始给药。

1.3.3 动物分组及给药

建立乳腺癌裸鼠模型后，称量裸鼠给药前体质量，用Excel软件按分层随机分组法将40 只裸鼠随机分为模型组（生理盐水0.2 mL/dmb）、昆布多糖低剂量组（50 μg/kgmb）、昆布多糖高剂量组（200 μg/kgmb）和阳性对照组（盐酸阿霉素，0.4 μg/kgmb），共4 组，每组10 只，分笼饲养。连续饲养50 d，隔天灌胃给药。第51天脱颈椎处死裸鼠，剥离肿瘤与肝脏并拍照记录。

1.3.4 肿瘤体积及抑瘤率的测定

在给药期间，每2 d称量裸鼠的体质量，用游标卡尺测量并记录肿瘤的长径和短径，并按公式（1）计算肿瘤体积，按公式（2）计算抑瘤率，以观察昆布多糖对荷瘤裸鼠的影响[18]。

1.3.5 裸鼠血液学指标分析

在给药结束后，裸鼠禁食过夜，眼球取血测定血液学指标[19]。

1.3.6 病理学组织观察

在第51天采血后处死裸鼠并进行解剖，将裸鼠的肝脏和肿瘤浸泡于体积分数10%福尔马林溶液中固定7 d，之后流水冲洗过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片，切片厚度为4.0～4.5 μm。将切片依次置于二甲苯I（20 min）、二甲苯II（20 min）、无水乙醇I（5 min）、无水乙醇II（5 min）、体积分数75%乙醇溶液（5 min），以自来水冲洗。切片于苏木精染液染色3～5 min后以自来水冲洗，以分化液分化后以自来水冲洗，以返蓝液返蓝后再次洗。将切片依次置于体积分数85%、95%乙醇溶液中脱水各5 min，于伊红染液中染色5 min。将切片依次置于无水乙醇I（5 min）、无水乙醇II（5 min）、无水乙醇III（5 min）、二甲苯I（5 min）、二甲苯II（5 min）透明，中性树胶封片。采用显微镜镜检并对图像进行分析。

1.3.7 血清细胞因子质量浓度检测

裸鼠眼球取血，收集1.0～1.5 mL血液置于EP管中静置4 h后，3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液冻存待检[20]。检测前令上清液平衡至室温，按ELISA试剂盒方法进行操作，检测裸鼠血液中IL-2、IL-6、TGF-β及TNF-α质量浓度。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 22.0软件进行数据处理，结果以平均值±标准差表示，对数据进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 昆布多糖对裸鼠体质量、肿瘤尺寸及抑瘤率的影响

如表1所示，在实验期间，各实验组裸鼠的体质量与模型组间无显著性差异。此外，各实验组裸鼠的饮食、排泄、毛色等指标均正常，解剖脏器的外观形态也无异常变化，说明昆布多糖有较高的安全性。

表1 裸鼠体质量的变化（n＝10）Table 1 Changes in body mass of nude mice (n = 10) g

由表2可以看出，给药34 d和50 d后，相比于模型组，阳性对照组、WLP5高剂量组裸鼠的肿瘤长径均极显著减小（P＜0.01）；如表3所示，相比于模型组，给药34 d和50 d后WLP5高剂量组和阳性对照组裸鼠的肿瘤短径均极显著减小（P＜0.01），而WLP5低剂量组裸鼠的肿瘤短径则在给药50 d后极显著减小（P＜0.01）。

表2 裸鼠肿瘤长径的变化（n＝10）Table 2 Changes in long diameter of tumors in nude mice (n = 10)cm

表3 裸鼠肿瘤短径的变化（n＝10）Table 3 Changes in short diameter of tumors in nude mice (n = 10)cm

如表4所示，相比于模型组，WLP5高剂量组裸鼠在34 d时肿瘤体积极显著减小；给药50 d后，相比于模型组，其余3 组裸鼠肿瘤体积均极显著减小（P＜0.01），说明在给药50 d左右，昆布多糖对肿瘤开始表现出明显的抑制作用，而高剂量的昆布多糖则可更早地发挥作用。这为临床试验提供了理论依据。

表4 裸鼠肿瘤体积变化（n＝10）Table 4 Changes in tumor volume in nude mice (n = 10)mm3

各实验组裸鼠的肿瘤解剖图如图1所示。根据肿瘤体积计算抑瘤率。给药结束后，WLP5低剂量组与高剂量组的抑瘤率分别为36.5%和48.9%，说明WLP5具有明显的抑瘤效果，且存在一定的剂量-效应关系。虽然昆布多糖的抑瘤率略低于阳性对照组（58.2%），但由于昆布多糖完全来自于食物，有着较好的安全性，其在肿瘤治疗的应用方面前景广阔[21]。

图1 裸鼠肿瘤解剖图Fig. 1 Anatomical pictures of tumors in nude mice

2.2 昆布多糖对裸鼠血液学指标的影响

血液在人体中参与体液调节和氧气运输，可以起到调节体温并维持内环境稳态等作用。通常来说，人体中各部位稍有异常病变，都会由血液携带其各种信息传达出来，所以检查血液中各种细胞成分数量及比例等的变化可协助判断机体各种组织器官的病变情况。如表5所示，阳性对照组裸鼠的淋巴细胞比率、单核细胞比率和单核细胞计数3 种血液指标以及WLP5高剂量组单核细胞比率、平均血小板体积与模型组存在显著或极显著差异，其他指标均无明显差异。淋巴细胞是白细胞的主要成分，阳性对照组裸鼠的白细胞总数较模型组有所减少，且淋巴细胞比率较高（46.04%），说明此时阳性对照组裸鼠机体的免疫力较为低下，可能存在病毒感染症状；同时，阳性对照组裸鼠的单核细胞计数（0.04）显著低于模型组（0.20），且单核细胞比率也较低，对于单核细胞，其数量可能在机体受到感染、机体防御能力被破坏时降低，这是因为单核细胞与粒细胞有相同的祖细胞，成熟的单核细胞由骨髓释放进入血液，当机体发生感染或受到损伤时，单核细胞会迅速聚集并进入感染或损伤的组织中分化成巨噬细胞，释放干扰素、IL等参与机体防御机制[22]。与模型组相比，WLP5高剂量组裸鼠的单核细胞比率显著降低，而白细胞数量、平均血小板体积有所升高和增加，表明WLP5可能激活并促进了免疫反应；血小板由骨髓中的巨核细胞产生，在尚未成熟时体积相对较大，由骨髓中巨核细胞新产生的血小板由骨髓释放至外周血的数量偏多会导致平均血小板体积升高[23]，即WLP5高剂量组裸鼠骨髓产血小板功能相对活跃。

表5 昆布多糖对裸鼠血液学指标的影响Table 5 Effect of L. japonica polysaccharide on hematological parameters of nude mice

2.3 裸鼠肝脏组织和肿瘤组织的病理学观察

由图2可见，各实验组裸鼠肝脏组织结构完整，细胞排列均匀，胞浆丰富，肝小叶、肝索和肝窦结构可辨，肝细胞结构清晰，细胞核清晰可见，相互间界限明显，无明显异常[24]。表明低剂量和高剂量昆布多糖都对正常细胞几乎无毒，副作用很小，其临床应用是安全的。

图2 裸鼠肝脏病理学组织变化Fig. 2 Histopathological changes of liver tissue in nude mice

正常情况下肿瘤细胞和T细胞的细胞核在细胞中所占比例较大，实体瘤内细胞的细胞核被染成蓝紫色，而细胞浆、结缔组织等会被染成深浅不同的红色，从而能够分辨出病变的组织或细胞[25]。由图3可以看出，相较于肝脏组织，肿瘤细胞中的蓝紫色更明显。模型组肿瘤细胞排列紊乱、形态异常，胞内有胞脂肪变性和空泡，瘤组织边缘有炎性浸润，还有少量坏死细胞；WLP5低剂量组肿瘤细胞的形态与模型组相近，存在部分细胞变性坏死；而WLP5高剂量组与阳性对照组的肿瘤细胞形态相似，出现大面积坏死区域，细胞核消失，说明高剂量的昆布多糖对肿瘤细胞有着抑制并诱导凋亡的作用。

2.4 昆布多糖对裸鼠细胞因子释放量的影响

如表6所示，与模型组相比，WLP5低剂量组和高剂量组裸鼠的IL-2、IL-6释放量均显著或极显著提高（P＜0.05，P＜0.01）。IL-2和IL-6释放量的升高说明昆布多糖极有可能是通过激活免疫系统，促进IL-2和IL-6的分泌，调节淋巴细胞的生长分化、激活巨噬细胞来实现抑制肿瘤的作用。IL-6和TNF-α作为多效细胞因子，与炎症的发展及多种肿瘤的发生密切相关[26]。瞿秋红等[27]的研究表明，上调IL-6基因表达、下调TPD52及TNF-α基因表达可抑制子宫肌瘤细胞增殖并诱导其凋亡。本研究中，相较于模型组，WLP5低剂量与高剂量组裸鼠TNF-α的释放量随WLP5剂量的增加呈现下降趋势，表明昆布多糖可能通过下调TNF-α的表达，从而下调基质金属蛋白酶等与肿瘤转移侵袭有关的细胞因子表达[28]，进而发挥抗肿瘤作用。TGF-β可以在肿瘤发展初期抑制肿瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡，但是到了肿瘤发展阶段，TGF-β的作用会发生转变，其抑癌作用减弱而促癌作用增强[29-30]，WLP5低剂量组与高剂量组裸鼠的TGF-β表达量与模型组相比均有所减少，说明昆布多糖可能通过抑制TGF-β的表达，从而抑制其促癌作用，进而达到抑制肿瘤细胞的效果。

表6 昆布多糖对裸鼠细胞因子释放量的影响Table 6 Effect of L. japonica polysaccharide on the release of cytokines

褐藻在我国沿海地区分布广泛，是一类重要的海洋生物资源，近年来，褐藻多糖以其优异的抗肿瘤活性受到研究人员越来越多的关注。常见的褐藻包括等昆布、萱藻、羊栖菜、裙带菜等，Han Yun等[31]对裙带菜多糖中分离得到的裙带菜多糖SPUP组分进行抗肿瘤活性研究，结果表明SPUP（100～300 mg/kgmb）可明显抑制7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethyltetraphene，DMBA）诱导的乳腺癌大鼠乳房异常增大，降低肿瘤发生率。免疫疗法是目前抗肿瘤的重要手段之一，SPUP被证明可通过提升脾脏和胸腺指数，拮抗乳腺癌大鼠的免疫抑制[31]。Fan Sairong等[32]构建HepG2肝癌小鼠模型，发现羊栖菜多糖SFPS（100、200、400 mg/kgmb）可显著抑制肿瘤生长，提高小鼠IL-1、NO水平，并通过上调Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）表达来促进HepG2细胞凋亡，同时促进脾脏的生长。在本研究中，观察到昆布多糖WLP5（50、200 μg/kgmb）可通过刺激细胞因子IL-2和IL-6的分泌来激活乳腺癌裸鼠的免疫反应并抑制肿瘤生长，也证明免疫系统的激活在抗癌中具有重要作用。Vishchuk等[33]发现裙带菜多糖组分UpF2对乳腺癌T-47D细胞有显著的抑制作用，认为该抑制活性与其结构中含有较多的β-D-半乳糖和岩藻糖有关。本课题组前期对昆布多糖WLP5单糖组成的测定结果表明，WLP5由D-甘露糖、核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、木糖、岩藻糖组成，其物质的量比为1∶0.39∶0.88∶1.89∶2.37∶1.81∶12.56[17]，可看出其中岩藻糖和D-半乳糖占比较大，该组分在体外抗肿瘤实验中对MCF-7细胞也表现出较好的抑制活性，与Vishchuk等[33]的结论一致，因此推测岩藻糖和D-半乳糖占比更高的WLP5组分可能在MCF-7荷瘤裸鼠的抗肿瘤活性中也发挥着巨大的作用。褐藻糖胶（岩藻聚糖）是一种特殊的天然硫酸化多糖，存在于各种棕色海藻细胞壁基质中，Palanisamy等[34]的研究表明，羊栖菜中的褐藻糖胶（150 μg/mL）对MCF-7乳腺癌细胞的抑制率可达90.4%；从褐藻Saccharina cichorioides中提取的褐藻糖胶增加了HCT-116人结肠癌细胞对白藜芦醇的敏感性，二者联合使用显著提升了白藜芦醇的抗肿瘤作用[35]。褐藻多糖优异的抗肿瘤活性提示多糖可作为潜在的癌症预防药物或辅助化疗药物。

3 结 论

本研究通过对昆布多糖干预荷瘤裸鼠肿瘤体积变化、肝脏及肿瘤病理学组织切片观察、血液学指标和细胞因子释放的测定，考察了昆布多糖在体内的抗肿瘤活性。裸鼠的生长情况、体质量变化以及肿瘤的尺寸都是反映药物作用最基本的数据。结果表明，各实验组裸鼠的体质量在整个实验期间没有产生明显差异，裸鼠的饮食及排泄等指标均正常。在给药34 d后，WLP5高剂量组裸鼠的肿瘤体积显著小于模型组。低剂量与高剂量WLP5最终的抑瘤率分别为36.5%和48.9%，表明昆布多糖对肿瘤有较强的抑制作用。对裸鼠血液指标的检测结果表明，高剂量WLP5降低了单核细胞比率并增加了血小板平均体积，该组其余各项指标与模型组相比并无显著性差异。对细胞因子释放量的测定结果表明，低剂量和高剂量WLP5均显著或极显著促进了IL-2和IL-6的释放，而TNF-α与TGF-β的释放量减少。裸鼠肝脏、肿瘤组织的HE染色结果表明，WLP5对肝脏细胞不具有毒性作用，各实验组裸鼠肝脏细胞形态均正常；而WLP5高剂量组裸鼠的肿瘤细胞则出现了大面积坏死等现象。综上所述，昆布多糖作为天然活性物质，具有较强的抗肿瘤作用，且无明显毒性，其在乳腺癌的临床治疗方面具有潜在的应用价值。