超声协同壳聚糖处理对蛋黄液乳化性质及蛋黄蛋白质结构的影响

马 婕，杨晓雪，迟玉杰,*，迟 媛

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学工程学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

蛋黄因其较高的营养价值、浓郁的感官风味和良好的乳化特性而广泛应用于蛋黄酱、沙拉酱和焙烤食品等的制作。蛋黄在食品中主要的功能特性是乳化性质，通过将油和水融合，形成完全分散的乳浊液，有助于提高食品的口感、掩盖不良风味[1]。蛋黄常用于制作油酥性面团、蛋糕面糊、蛋挞等焙烤食品，可以使各种脂溶性成分与水更好地结合，使其口感更加柔软，因此改善蛋黄乳化性质可以扩大其在食品工业中的应用范围。提高蛋黄乳化性质可以改善其作为天然乳化剂的品质，减少食品工业对人工合成乳化剂的依赖。因此，为研究具有良好乳化性质的蛋液并在实际生产中应用，本研究通过超声协同壳聚糖处理的手段提升蛋黄的乳化性质，并研究其乳化性质与结构特性之间的关系。

壳聚糖由N-乙酰葡萄糖胺通过β-1,4-糖苷键连接而成，由甲壳素经过脱乙酰作用得到，是一种绿色安全的可再生资源，甲壳素脱去55%以上的N-乙酰基时就可被称为壳聚糖[2]。壳聚糖与蛋白质的非共价聚合可以改善乳液的乳化性质，使得蛋白质-多糖复合物具有优于单一蛋白质的特性[3]。Schulz等[4]的研究表明壳聚糖能够稳定水-油-水型多重乳液，其亲水亲油平衡值大约为36.7，亲水性较强。Torrico等[5]发现壳聚糖对蛋黄内部品质不仅有保鲜作用，还可以起到乳化剂的效果，即壳聚糖可有效改善蛋黄的乳化性质。Zhang Lijuan等[6]基于静电相互作用，开发了鳕鱼蛋白/壳聚糖复合颗粒，显著提高了其乳液稳定性，并改善了乳液的黏弹性和触变性。

超声处理是一种公认的绿色无公害食品加工技术，其应用成本低，超声处理下蛋黄颗粒的理化性质及微观结构都会发生一定变化[7]。超声处理可用于改善蛋白质的特性，如起泡性、凝胶性和乳化性质等[7-9]。蛋黄中含有丰富的低密度脂蛋白，它提供了主要的乳化活性[10]。杜清普等[11]的研究表明超声处理后冰蛋黄的乳化活性提高了7.54%。Li Qiqi等[12]发现超声处理导致蛋黄颗粒粒径减小，而表面疏水性增大；毕雅雯等[13]发现150 W超声处理后蛋黄液乳化性质得到改善，粒径及乳析指数显著降低。因此利用超声处理蛋黄液，通过改变其蛋白结构而改善其乳化性质的方法是可行的。

目前，超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳化性质的影响及其与蛋白结构之间的关系鲜有报道，故本研究在单一条件改性的基础上，采用超声协同壳聚糖处理鸡蛋黄，以期为改善蛋黄的乳化性质提供依据，并为进一步将其应用于生产实践提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜A级鸡蛋（平均质量为45～55 g）由黑龙江省哈尔滨市双城区某农场生产；大豆油 哈尔滨九三油脂有限责任公司；壳聚糖（脱乙酰度80%～95%） 国药集团化学试剂有限公司；4×天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）上样缓冲液、考马斯亮蓝G-250 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

超声破碎仪 美国Sonics公司；JJ-1精密定时电动搅拌器 上海浦东物理光学仪器厂；HWS-24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；T18型高速匀浆机 德国IKA公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；BX53型科研级正置显微成像系统 日本奥林巴斯公司；S-3400N型钨灯丝扫描电子显微镜、F-7100型荧光分光光度计 日本日立公司；HAAKE MARS40流变仪、Nicolet IS50型傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔公司；Mastersizer 2000型激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；*Theta型视频光学角 瑞典百欧林公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋黄液样品的制备

手工破碎新鲜的鸡蛋，使用分蛋器将蛋黄与蛋清分离，将鲜蛋黄（fresh egg yolk，FEY）慢慢搅拌以备后续使用。向蛋黄液中加入1.5 g/mL的壳聚糖充分搅拌2 h至壳聚糖完全溶解于蛋黄液中，置于冰水混合物中降温，使用200 W的功率对样品进行共10 min（开启3 s、停止 2 s）的间歇超声处理，制成超声协同壳聚糖蛋黄（ultrasonic chitosan egg yolk，UCEY）。对照组样品包括：1）加壳聚糖蛋黄（chitosan egg yolk，CEY），即向FEY中加入终质量浓度1.5 g/mL壳聚糖并且充分搅拌2 h的蛋黄；2）加热蛋黄（heated egg yolk，HEY），即FEY经过54 ℃加热处理的蛋黄；3）加壳聚糖加热蛋黄（chitosan heated egg yolk，CHEY），即FEY加入终质量浓度1.5 g/mL壳聚糖后，54 ℃加热处理的蛋黄；4）超声蛋黄（ultrasonic egg yolk，UEY），即对FEY进行200 W间歇超声处理10 min（开启3 s、停止2 s）的蛋黄。用超声仪器自带的测温装置多次检测显示超声探头中心部位的蛋黄温度为（54±2）℃。这可能是由于蛋黄液黏稠，冰块的温度无法传递到超声中心，难以使探头周围的蛋黄液降温。蛋黄属于热敏性物质，超声中心的脂蛋白受热变性聚集可使其加热后黏度增大甚至凝固，为避免温度对结果的影响，本研究设置54 ℃加热的对照组HEY。

1.3.2 乳化活性和乳化稳定性的测定

乳化活性和乳化稳定性的测定参考Tang Chuanhe等[14]的方法并稍作改动。用蒸馏水将蛋黄液稀释为蛋白质量浓度0.01 g/mL的溶液，将20 mL溶液与5 mL大豆油用高速匀浆机以10 000 r/min均质1 min，获得乳液。在均质后0 min与5 min时，分别从底部吸取400 μL清液，采用40 mL 0.1 g/mL的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液稀释，以相同质量浓度的SDS溶液作为空白对照，在500 nm波长处测定乳液的吸光度，每个样品平行测定3 次。分别按照公式（1）、（2）计算乳化活性指数（emulsification activity index，EAI）与乳化稳定性指数（emulsification stability index，ESI）。

式中：T＝2.303，为ln 1的近似值；N为稀释倍数；ρ为乳化前溶液中蛋白质量浓度/（g/mL）；φ为油相体积分数/%；A0为0 min时的吸光度；A5为5 min时的吸光度；Δt为时间差（5 min）。

1.3.3 乳液粒径的测定

采用Zhao Wenfei等[15]的方法，用蒸馏水将1 g蛋黄稀释20 倍质量，磁力搅拌至完全溶解，加入5 mL大豆油，在12 000～13 000 r/min的转速下均质1 min，以获得乳液；吸取80 μL乳液分散至40 mL蒸馏水中，测定其粒径分布。参数设置如下：样品折射率1.46，水折射率1.33。

1.3.4 乳液微观结构的光学显微镜观察

采用Hu Chun等[16]的方法观察乳液微观结构，将10 μL 1.3.2节中新鲜乳液置于载玻片上，用盖玻片覆盖，平衡2 min后采用科研级正置显微成像系统放大50 倍后观察并拍摄照片。

1.3.5 蛋黄表面形貌的扫描电子显微镜观察

参考Tian Xiaolu等[3]的方法并稍作修改，取少许蛋黄冻干样品固定在铝样品台上，喷金200 s。在扫描电子显微镜下放大200 倍观察不同蛋黄的表面形貌并拍摄照片。

1.3.6 流变学性质的测定

参考Zhao Wenfei等[15]的方法测定蛋黄液的流变特性。选择平行板直径为35 mm。25 ℃下在0.1～10 Hz的频率范围内进行动态振荡频率扫描，固定应变值为0.5%，板间隙为0.3 mm。设定剪切速率范围为0.1～100 s－1，在25 ℃下测定样品的表观黏度。

1.3.7 界面张力的测定

参照Aris等[17]的方法测定1.3.2节中乳液在油-水界面上的界面张力。将连接在毛细管上的不锈钢针插入装满大豆油的玻璃比色皿中，从针尖滴入5 μL液滴到大豆油中，持续1 h检测界面张力的变化情况，每个数据点的时间间隔为0.5 s。之后基于液滴形状分析，根据杨-拉普拉斯方程计算界面张力，每个样品测定3 次取平均值。

1.3.8 SDS-PAGE测定

根据Qing Mingmin等[18]的方法，使用12%分离胶和3%浓缩胶，将蛋黄液稀释为蛋白质量浓度为10 mg/mL的溶液。将样品和上样缓冲液（含有β-巯基乙醇）以体积比1∶1混合后在沸水浴中反应5 min，上样样品含20 μg蛋白质。使用实验室凝胶成像系统获取图像信息。

1.3.9 傅里叶变换红外光谱测定

蛋黄样品冻干后将冻干样品切成薄片，并使用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪记录4 000～400 cm－1范围内的光谱。扫描分辨率为4 cm－1，使用PeakFit v4.12软件进行积分，以获得次级导数谱的峰面积。通过酰胺I带（1 700～1 600 cm－1）吸收峰的高斯反卷积获得每个二级结构的相对含量。

1.3.10 荧光光谱及疏水性测定

将不同方法处理的蛋黄液用pH值为8.0的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释为0.1 mg/mL，按如下参数测定样品在最大发射波长下的荧光强度：激发波长为280 nm，发射波长为300～420 nm，狭缝宽度为2.5 nm，扫描间隔为1 nm，扫描速率为1 200 nm/min。以相对荧光强度为纵坐标、蛋白质量浓度作为横坐标作图，以其斜率表示样品的表面疏水性。

1.4 数据统计与分析

本研究所得数据均为3 次重复测定的平均值，使用SPSS软件（版本26.0）进行数据分析。使用单因素方差分析法进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著。采用Origin 2022软件进行数据拟合和绘图。采用PeakFit v4.12软件进行多峰拟合。

2 结果与分析

2.1 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液乳化活性及乳化稳定性的影响

与对照组FEY（EAI为（10.98±0.15）m2/g，ESI为（6.65±0.21）min）相比，CHEY、UEY和UCEY的乳化活性分别显著升高了21.77%、18.49%和29.51%（P＜0.05），乳化稳定性分别显著升高了6.48%、6.66%和9.47%（P＜0.05）（图1）。

图1 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液乳化活性及乳化稳定性的影响Fig. 1 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on emulsifying activity and emulsion stability of egg yolk emulsion

超声协同壳聚糖处理后蛋黄液会逐渐变得黏稠，其黏度的升高提示蛋黄液内部蛋白形成三维网状结构，液滴之间存在较大的静电斥力，因此不易聚集，从而使其乳化活性及乳化稳定性升高，这可能是由于蛋白质分子之间的相互作用增强所导致的。根据Xie Yunxiao等[19]的研究结果，超声处理可能会增加蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的水合作用，导致其更紧密地连接。EAI的改善可能归因于分子柔韧性的提高，其得益于均匀的颗粒分布，说明适度的超声及壳聚糖处理可以改善蛋黄的乳化性质[20-21]。油-水乳化体系的特性受蛋白浓度、添加油的体积分数、搅拌速度及搅拌时间等因素影响[22]。对于乳化稳定性，搅拌速度的影响最为显著。本实验中各处理组的均质时间均为1 min，因此CEY、CHEY、UEY和UCEY的ESI差异不显著（P＞0.05）。与上述4 组相比，HEY的ESI显著较低，这可能是由于温度的提高使部分脂蛋白变性聚集，蛋白质分子柔韧性减弱，其在油-水界面的稳定性降低，从而引起ESI降低。

2.2 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液粒径的影响

蛋黄乳液样品的粒径为微米级，可通过动态光散射技术测定蛋黄样品颗粒聚集体的粒径变化，从而反映超声协同壳聚糖处理对蛋黄中脂蛋白聚集程度的影响[23]。除HEY，所有处理组的粒径图像相较于未超声样品都向左移动，CHEY、UEY和UCEY的平均粒径分别为104.70、104.68 μm和62.23 μm，其中UCEY的粒径减小最明显，与FEY相比减小了50.01%（图2）。

图2 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液粒径的影响Fig. 2 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on particle size of egg yolk emulsion

超声协同壳聚糖处理对乳液粒径的影响与图1中EAI的测定结果相印证，较小的粒径说明液滴较分散，这可能是由于超声处理使蛋白质分散，使得乳液由紧密的聚集体变得分散，从而使具有疏水性的官能团快速迁移到油-水界面并稳定乳液，200 W超声处理引起的空化效应产生了高剪切能量和湍流，为蛋白质分子的碰撞和解离提供了足够的能量。蛋白质分子由于分子间相互作用被破坏及化学键被解离形成小分子，从而使蛋白质粒径减小，表面积增大，蛋白质与油相吸附的可能性增大，乳化性质得到改善。CEY中壳聚糖的加入使带正电的壳聚糖通过静电相互作用移动到带负电荷的乳液层，其与蛋黄蛋白的复合提供了较大的空间阻力，使乳液粒径减小。

2.3 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液界面张力的影响

油-水界面被认为是厚度无限小的平面，但是界面区域/膜本质上是动态的，例如在一个区域内有水-水（氢键）、油-油（范德华力）和水-油（疏水效应，其中水分子远离非极性甘油三酯以尽量减少与其接触）3 种分子间相互作用力。本研究中超声处理时，蛋黄的界面张力在一定时间内明显下降，之后随时间的延长变化趋于平缓，在达到峰值时UCEY的界面张力较FEY降低了16.67%（图3）。

图3 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液界面张力的影响Fig. 3 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on interfacial tension of egg yolk emulsion

FEY、CEY和HEY的界面张力曲线在超声处理的前200 s较陡，而超声协同壳聚糖处理不仅可以降低界面张力，与其他实验组相比，UCEY的界面张力曲线更加平滑，且更快达到平衡状态，说明其具有较高的吸附速率、较平衡的表面张力及较低的膨胀表面模量。CEY界面张力的降低可能是由于壳聚糖与脂蛋白经过静电相互作用复合后，提高了复合颗粒的疏水性。超声处理200 s后CEY、UEY与UCEY的界面张力曲线有相似的变化趋势，且平滑程度相当，但UCEY的初始界面张力更低，说明超声与壳聚糖处理对界面张力的降低存在着一定程度的协同作用。超声协同壳聚糖处理可以抑制蛋黄蛋白的相互聚集，有利于蛋白颗粒更快地移动到油-水界面，形成强而致密的吸附层，导致界面张力降低，通过防止油滴的聚集和絮凝提高体系稳定性。

2.4 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液微观结构的影响

显微图片可以直观地显示出乳液的分散特性，本研究观察了放大50 倍后的蛋黄乳液液滴。未经过处理的蛋黄乳液液滴不均匀地分散，且大小不一，较为密集地聚集在一起；HEY乳液液滴明显增大，且出现更加明显的聚集和絮凝；CHEY乳液液滴粒径相对较小，粒径分布更为均一；而UCEY乳液液滴更加细小，最为均一地分布于视野之中（图4）。

图4 超声协同壳聚糖处理对蛋黄乳液微观结构的影响Fig. 4 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on microstructure of egg yolk emulsion

UCEY中包裹油滴的界面蛋白之间会产生较强的空间阻力，使油滴形成规则的球形，并同时伴随着乳液稳定性的上升。这可能是由于超声及壳聚糖处理改变了卵黄颗粒的聚集形态和蛋白质的构象，使其微观结构更加紧密细致，分子间作用力增大，抑制液滴颗粒的聚集，从而使絮凝现象减少，表明超声及壳聚糖协同处理有助于油滴的均匀分布。多糖中的亲水基团可以阻止由于静电排斥缺乏而引起的聚合现象。显微图片观察到CEY的乳液微粒较FEY略大，边缘颜色较深，液滴壁较厚，表明带正电的壳聚糖通过静电相互作用形成复合颗粒，从而形成较厚的膜，或是存在未反应完全的壳聚糖颗粒。

2.5 超声协同壳聚糖处理对蛋黄聚集程度的影响

本研究用扫描电子显微镜放大200 倍观察蛋黄冻干颗粒的聚集程度。未经处理的FEY颗粒较大，部分颗粒彼此黏连，凝结在一起，总体呈不规则且不均匀分布。与FEY相比，CEY和CHEY颗粒较小，且分布更加松散；HEY颗粒发生了明显的热聚集；UCEY颗粒尺寸减小，且分布更加均匀（图5）。

图5 超声协同壳聚糖处理对蛋黄聚集程度的影响Fig. 5 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on the degree of aggregation of egg yolk

扫描电子显微镜图像表明超声协同壳聚糖处理对蛋黄结构的影响程度大于超声或壳聚糖单一处理，这与超声产生的空化和微湍流效应有关，超声处理后蛋黄粉的颗粒结构被破坏并分裂为大量碎片，产生了不规则的孔状结构，出现不同程度的凹陷、裂纹和片状凸起，颗粒大小也变得更加不均匀。超声处理使蛋黄颗粒的微观结构变得更紧密，其可对蛋白质的构象和蛋黄颗粒中的物质组成产生影响，改变颗粒的聚集状态。壳聚糖与蛋黄蛋白发生了反应，促进了分子之间的相互作用，使蛋黄颗粒结构更加稳定。超声协同壳聚糖处理使结构紧密的蛋白质分子展开并暴露于活性残基之中，从而使蛋黄颗粒更加分散、均匀，表明超声协同壳聚糖处理蛋黄可有效改善其颗粒结构。

2.6 超声协同壳聚糖处理对蛋黄液流变学特性的影响

本研究使用模块化旋转流变仪测定蛋黄液的流变性质，并监测样品的动态黏弹性。频率扫描测试包括2 个独立参数，储能模量G’又称弹性模量，反映了蛋黄的弹性特性；损耗模量G”又称黏性模量，反映了蛋黄的黏性特性。频率扫描的结果经常用于检验样品的稳定性和内部组织变化情况[24]。各组蛋黄液的G’和G”变化趋势大致相同，且G’与G”的数值与扫描频率呈正相关，与Xu Lilan等[25]对蛋黄进行频率扫描后观察到的结果类似，意味着弹性行为并未占主导地位，所有处理组蛋黄的G”均大于G’，说明蛋黄表现出流体的性质（图6）。蛋黄中蛋白质分子间相互作用力的增强会使其黏性增大，并且其弹性模量与黏性模量都随之增大。本研究中UCEY的弹性模量和黏性模量均最高，说明超声协同壳聚糖处理使蛋黄中蛋白质的多肽链展开，疏水作用增强，并且壳聚糖的添加使蛋黄液黏度增加，流动性变差，形成更加紧密的网络结构，从而导致G’增大，最终促使蛋黄体系的稳定性得到改善。CEY与UEYG’和G”的变化趋势与UCEY相似，但UCEY的性质改善更加明显，表明超声与壳聚糖处理存在协同作用，其共同使蛋黄蛋白质分子相互作用增强，并使液滴间网络结构更加稳固。

图6 超声协同壳聚糖处理对蛋黄液流变学特性的影响Fig. 6 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on rheological properties of liquid egg yolk

表观黏度是蛋黄液的基本功能指标，指在一定的速率梯度下剪切应力与速率之比。表观黏度为食物乳液和其他悬浮颗粒提供物理支持，可直观地反映出液体的流动性。蛋黄液的表观黏度随着剪切速率的增加而减小，表明所有蛋黄液都是假塑性流体，具有剪切变稀的特性，是非牛顿流体。蛋黄颗粒之间通过各种作用力形成较稳定的三维网络结构，阻碍油滴的流动，使其具有一定的黏性。UCEY和CHEY的表观黏度明显高于FEY（图7）。根据Ma Zihong等[26]的研究，糖对蛋黄中铁或铜的螯合作用可能会限制或减少蛋白质结构的交叉键合，抑制蛋白质分子的聚集。壳聚糖的加入不仅改变了蛋黄液的聚集状态，形成较大的液滴阻碍流动行为，还可能改变液滴的带电情况，使液滴间排斥力增大，从而增加流动阻力。较高的黏度可以有效阻止液滴聚集，使乳液粒径减小，增加蛋黄液的乳化稳定性，与2.2节粒径的测定结果相印证。仅经过超声的UEY表观黏度较小，而UCEY的表观黏度较大，表明加入壳聚糖可明显改善蛋黄液黏度及乳化性质。

图7 超声协同壳聚糖处理对蛋黄液表观黏度的影响Fig. 7 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on apparent viscosity of liquid egg yolk

2.7 SDS-PAGE分析结果

SDS-PAGE是反映蛋白质分子质量变化最直观且便捷的方法之一，用于对蛋白质的亚基分子质量进行分析，SDS能使肽链伸展，破坏蛋白质原有的二、三级结构，β-巯基乙醇切断了半胱氨酸之间的二硫键，排除由于二硫键引起蛋白质聚集的可能性，使蛋白质分子的移动速率仅与其亚基分子质量相关[27]。SDS-PAGE能反映蛋黄中蛋白质与壳聚糖发生的共价连接情况以及超声对于蛋黄蛋白质分子质量的影响。

根据Wang Ruihong等[28]的研究，蛋黄液中主要含有低密度脂蛋白和卵黄球蛋白，蛋黄颗粒中主要含有高密度脂蛋白和卵黄高磷蛋白，分子质量为130 kDa的蛋白含量最多，其次是55～80 kDa的蛋白，本研究的测定结果与之相符。CHEY和UCEY各亚基组分的条带相较于FEY明显较浅，HEY条带颜色相较于FEY变化最大，FEY和CEY之间条带颜色无明显差异（图8）。

图8 超声协同壳聚糖处理对蛋黄蛋白SDS-PAGE图谱的影响Fig. 8 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on SDS-PAGE pattern of egg yolk proteins

蛋白条带颜色变浅说明蛋白质聚集体被β-巯基乙醇和SDS分解，超声处理促进了疏水相互作用和巯基二硫键交换的反应，使疏水相互作用增强的同时二硫键断裂。蛋黄蛋白质与壳聚糖发生共价键结合减少了蛋白质中的自由氨基和巯基数量，即减少了与考马斯亮蓝发生显色反应的基团数量，使条带变浅或不显色。

2.8 FTIR分析结果

2.8.1 FTIR图谱分析

FTIR是检测生物聚合物之间相互作用并揭示分子微观结构变化的有力工具，其图谱中1 700～1 600 cm－1之间的吸收峰是由于肽键的C＝O伸缩和N—H氢键振动而产生，即酰胺I带。酰胺I带的迁移与蛋白质和多肽的二级结构密切相关。超声协同壳聚糖处理前后的蛋黄液FTIR图谱并无明显变化，但在酰胺带I处，FEY的峰值位于1 631.00 cm－1处，而CHEY的峰值位于1 632.45 cm－1处，向高波数方向移动，而UCEY的峰值位于1 633.41 cm－1处，发生明显蓝移（图9）。氢键的断裂可以提高化学键的力常数，从而使其吸收频率向高波数方向移动，因此推测超声协同壳聚糖处理后蛋白质分子由于氢键和肽键的断裂而展开，从而导致官能团结构改变。

图9 超声协同壳聚糖处理对蛋黄蛋白FTIR图谱的影响Fig. 9 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on FTIR spectrum of egg yolk proteins

2.8.2 酰胺I带的反卷积和曲线拟合

为进一步了解超声及壳聚糖处理对蛋黄蛋白质二级结构的影响，本研究测定了不同处理蛋黄蛋白质的二级结构。蛋白质改性后C＝O数量以及C＝O和N—H之间形成的氢键都会发生改变，通过FTIR可以进行分析鉴定。

由表1可以看出，CEY的无规卷曲相对含量比FEY增加7.19%，表明壳聚糖促使蛋黄蛋白质结构展开。UCEY的α-螺旋和无规卷曲相对含量分别比FEY增加了3.48%和5.26%，β-折叠和β-转角的相对含量分别比FEY减少了2.56%和14.04%。表明超声协同壳聚糖处理可以打开氢键结构，使β-结构含量减少，促进了蛋黄蛋白质从有序结构到无序结构的过渡。在加入壳聚糖并提高温度后，蛋白质结构更加伸展、无序，一些蛋白质的二级结构被破坏。蛋白分子中螺旋、折叠和转角结构的相对含量均发生了变化，它们之间在不同作用下相互转化或者转化为无规卷曲，蛋白质分子伸展。UCEY的蛋白质结构中出现了类似的变化，其蛋白质结构打开、疏水性提高，侧面说明超声及壳聚糖处理有利于蛋白质乳化性质的改善。

表1 超声协同壳聚糖处理对蛋黄蛋白质二级结构相对含量的影响Table 1 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on relative contents of secondary structures in egg yolk proteins%

2.9 超声协同壳聚糖处理对蛋黄蛋白质三级结构的影响

为了进一步研究超声协同壳聚糖处理对蛋白质三级结构的影响，本研究分析了蛋黄蛋白质的荧光光谱，其可以反映蛋白质构象变化以及是否形成复合物[29]。色氨酸残基的发射峰位置在340 nm波长附近，且蛋白质的荧光峰与色氨酸残基的荧光峰相同，即色氨酸残基的荧光峰位置是反映蛋白质构象变化的敏感指标，色氨酸残基的变化会导致荧光猝灭或峰位置偏移[30]。

从图10可以看出，与FEY相比，经过处理的蛋黄荧光光谱峰值降低，说明经过处理的蛋黄中色氨酸残基发生荧光猝灭，可能是由于超声协同壳聚糖处理使得蛋白质空间结构伸展，疏水的色氨酸残基从蛋白质内部转移到外部，从而使蛋白质结构由紧实变得松散，三级结构发生变化。UCEY的蛋白质三级结构变化最大，其荧光强度峰值为2 373，表明超声协同壳聚糖处理导致荧光猝灭，并使蛋黄中蛋白质由紧密状态转变为较为伸展的结构。

从波长的变化来看，FEY的最大峰值在336.3 nm波长处，与FEY相比，CHEY、UEY和UCEY的最大峰值位置都略有蓝移，最大峰值分别在335.6、336.0 nm和334.8 nm波长处，其中UCEY的最大峰值位置移动了0.45%，蛋白质的荧光强度和最大峰值位置的改变反映了色氨酸残基被氧化的程度及微环境的变化，蓝移的发生表明了蛋白质表面有色氨酸残基的暴露，但从图10中可以看出，蓝移现象并不明显，可以认为超声协同壳聚糖处理只改变了蛋白质的支链结构，对其空间结构影响不大。

2.10 超声协同壳聚糖处理对蛋黄蛋白质疏水性的影响

由图11可知，所有处理组的表面疏水指数均显著高于未处理组（P＜0.05）。其中FEY的表面疏水指数为8 110.80；UCEY的表面疏水指数最高，为9 157.33，与FEY相比提高了12.91%；其次是HEY和UEY，其表面疏水指数分别为9 030.47和9 004.10，但二者与UCEY之间没有显著性差异（P＞0.05）。

图11 超声协同壳聚糖处理对蛋黄蛋白质疏水性的影响Fig. 11 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on hydrophobicity of egg yolk proteins

蛋白质颗粒的表面疏水性对其在油-水界面的吸附性能（即蛋白的乳化性质）具有显著影响，蛋白质表面疏水性与其乳化能力呈正相关[31]。根据Ma Zihong等[26]的研究，经过物理处理后蛋白质结构发生变化，导致肽链断裂、蛋白质结构展开，暴露出脂肪族和芳香族氨基酸，其疏水表面暴露并与8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）结合，导致其表面疏水性增强。根据闫峥蓉等[32]的研究，表面疏水性越高的蛋白质乳化性质越好，蛋白质分子由于静电排斥等作用力而解聚，使其分子质量降低，从而使蛋白质更好地附着在油-水界面上。超声产生的空化效应、机械剪切和湍流形成局部瞬时的高压和高温，从而引起蛋白质的展开和扩展，使得原本包埋在蛋白质分子内部的疏水基团暴露，并与ANS发生相互作用。壳聚糖分子中疏水性的N-乙酰基-D-葡糖胺单元暴露于复合颗粒的表面，提高了复合颗粒的疏水性。疏水性的增加会导致液滴表面形成界面膜，使蛋白质更多地吸附在乳液界面，减缓油滴的凝结速度，从而使其乳化性质得到改善。

3 结 论

本研究结果表明，与未处理组相比，超声及添加壳聚糖处理使蛋黄液乳化性质提高了29.51%，乳液粒径减小了50.01%，揭示了超声协同壳聚糖处理后蛋黄液乳化性质与蛋白质结构之间的关系，证明超声协同壳聚糖处理是一种能够有效提高蛋黄液乳化性质的方法。经过超声协同壳聚糖处理后，蛋黄乳液液滴更加细小，液滴形状更加均匀，蛋黄蛋白质在油-水界面分布的均一性增加，超声协同壳聚糖处理后蛋黄蛋白质界面张力随时间延长的变化曲线更快达到平衡，说明其吸附速率提高，蛋黄液达到平衡的时间缩短。CEY、UEY与UCEY的EAI分别比FEY提高了1.18%、18.49%和29.51%；三者的界面张力有相似的变化趋势，且平滑程度相当，但UCEY的初始界面张力更低；CEY与UEY流变学性质变化趋势相同，但UCEY的流变学性质改善更加明显。说明超声与壳聚糖处理对界面张力的降低存在一定程度的协同作用。超声协同壳聚糖处理后蛋黄蛋白质结构展开，蛋黄冻干颗粒体积的均一性提高、蛋黄蛋白质的聚集程度降低。FTIR分析结果表明，与FEY相比，蛋黄蛋白质无规卷曲结构相对含量增加了5.26%，蛋白质更加无序分散，而无规卷曲结构有助于改善蛋白质的乳化性质。荧光光谱分析结果显示超声协同壳聚糖处理后蛋黄蛋白质中色氨酸残基更加倾向于暴露在外部，经超声协同壳聚糖处理的蛋黄蛋白质表面疏水指数最高（9 157.33），其三级结构由紧密状态转变为较为伸展的结构，与SDS-PAGE的结果相印证。较为松散的蛋白质结构有利于蛋黄液乳化性质的改善，超声协同壳聚糖处理可以打开蛋白质结构。本研究中经超声协同壳聚糖处理获得的UCEY显示出良好的作为高乳化性质原料的应用潜力，未来可将其应用于焙烤蛋液等专用蛋液中。