尿液脱落细胞块切片的制备

杜天海，吕丽霞，杨洁亮，彭恒，陈敏

四川大学华西医院病理科，成都 610041

尿路上皮癌是临床上常见的泌尿系统肿瘤之一，近年来发病率呈逐年上升趋势。尿脱落细胞学检测联合荧光原位杂交（FISH）技术是目前临床筛查尿路上皮癌的重要检测方法，具有无创、快速和准确等优点。传统的尿脱落细胞学和FISH 检测是在尿液细胞涂片直接染色后显微镜下进行检测分析，细胞涂片容易发生涂片厚、细胞堆积或分散、结构不清及细胞量少等情况，增加了临床医师的阅片难度，同时还降低了脱落细胞学检查的阳性率。快速、多量的采集尿液细胞并加以固定，有助于病理细胞学的诊断。为此，我们将36例疑似尿路上皮癌患者的新鲜晨尿样本制作成尿液脱落细胞块，观察尿液脱落细胞块切片在苏木素—伊红染色（HE）、免疫组织化学（IHC）及FISH 检测中的应用情况，探讨尿液脱落细胞块在常规病理诊断中的应用价值，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 仪器及设备 荧光显微镜Leica DMLS、Abbott ThermoBrite 原位杂交仪。细胞块试剂盒为昆明东环科技公司（内含内径为8 mm 或4 mm 的专用含基质离心管，细胞固定液和红细胞裂解液）、抗体为中杉金桥公司GATA3（克隆号：EP368）即用型抗体、探针试剂盒为北京金菩嘉公司（ CSP3/CSP16 和GLP7/GSP17）、DAPI 复染剂（Abbott 公司），胃蛋白酶（Sigma 产品）、NP-40（Sigma 产品）、柠檬酸钠缓冲液（Abbott 公司）。恒温水浴锅、离心机、橡胶水泥、环保透明剂、盐酸及乙醇为市售产品。

1.2 尿液脱落细胞块切片制备方法 收集2022 年7—8 月间四川大学华西医院连续送检的36 例临床怀疑尿路上皮癌患者的新鲜晨尿样本，每例份尿液样本＞200 mL，离体时间＜3 h。①尿液沉渣收集：取36 份尿液样本，分装入50 mL 离心管后，1 500 r/min离心10 min，离心后送检细胞学和FISH 检测，收集剩余尿液沉渣。②红细胞裂解：向尿液沉渣中加入约沉渣5 倍的专用红细胞裂解工作液，混匀后静置5 min，1 500 r/min 离心10 min 裂解红细胞，吸去上清液。③细胞固定：向沉淀的尿脱落细胞中加入5倍于沉渣的专用固定液，用吸管将细胞吹打分散，常温固定20 min。④加样：用金属浴融化专用含基质的离心管，85 ℃加热15 min，使离心管内基质完全融化。拧开红色离心管盖，用吸管将固定后的细胞悬液加入融化后的基质中并充分混匀（内径8 mm加样量约1 000 μL 和内径4 mm 加样量约400 μL），盖上离心管盖后趁热立即1 500 r/min离心5 min，使细胞富集到一个平面上。⑤凝固基质：离心富集细胞后将离心管放置4 ℃冰箱冷却10 min，充分凝固基质。⑥取材：拧开红色离心管盖，撕掉专用离心管底端的密封膜，用棉签从离心管盖处推出凝固后的基质，用刀片切下细胞富集端（底层细胞含有细胞团和大细胞，一般为病变细胞），放入组织包埋盒，进入与组织块相同的脱水程序。⑦常规石蜡包埋后切片。

1.3 尿液脱落细胞块切片制备效果观察 ①HE染色： 尿液脱落细胞块切片65 ℃烘烤10 min，依次将切片放入二甲苯和梯度酒精脱蜡至水，苏木素染色5 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，自来水冲洗，切片入伊红染液中染色2 min，再将切片梯度酒精脱水，二甲苯透明，晾干后中性树胶封片。②IHC：切片脱蜡至水后在3%双氧水浸泡10 min，纯水清洗，柠檬酸缓冲液高压锅中煮3 min，纯水清洗，PBS 洗2 次，加一抗于4 ℃过夜孵育。次日用PBS 冲洗切片数次，滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 冲洗切片数次，滴加DAB 显色5 min，纯水清洗苏木精复染15 s，纯水清洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。③FISH 染色：切片65 ℃烤片过夜，环保透明剂常规脱蜡，乙醇脱水，纯水高压修复4 min，37 ℃胃蛋白酶工作液消化15 min，0.1 mol/L 盐酸浸泡切片4 min，梯度乙醇脱水后晾干。滴加适量探针至组织区域后78 ℃变性5 min，37 ℃杂交过夜。次日梯度NP-40液清洗切片，二脒基苯基吲哚（DAPI）染色，荧光显微镜采图备用。在一个视野中，细胞所占的面积超过40%视为细胞量足够诊断，视为尿液脱落细胞块切片制备成功。

2 结果

36 例份尿液脱落细胞块切片HE 染色后显微镜下有15例份未观察到细胞或查见细胞极少，另21例份制备成功，且制备成的尿液脱落细胞块可4 μm连续切片，切片上细胞集中并单层平铺。低倍镜下可见尿液脱落细胞大小正常，结构清楚，切面形状规则，细胞丰富集中并单层平铺，背景干净，核仁清晰，细胞核和胞质对比清晰，其形态学结构与组织学非常相似，易于后续诊断。

21 例份尿液脱落细胞块切片后IHC 染色后显微镜下可见细胞定位准确，颗粒清晰，染色强度适宜，背景干净，易于后续诊断。21 例份尿液脱落细胞块切片FISH 荧光显微镜下可见细胞单层平铺，细胞核大小正常，形态轮廓清晰，荧光红绿信号清晰，背景干净，易于后续诊断。

3 讨论

尿路上皮癌是常见的泌尿系统肿瘤，近年来发病率逐年上升［1］。尿脱落细胞学涂片检查作为尿路上皮癌的常规检测，具有方法简便，特异性较高，对患者无损伤等特点，已在各层级医院被广泛应用。但常规涂片法对技术要求较高，制作的涂片往往要么细胞少而分散，要么细胞重叠堆积，观察费时，导致敏感度下降出现漏诊的情况，同时细胞学涂片还具有难还原组织学结构、不可重复切片和较难进行细胞染色等缺点，不适用于大规模的IHC 染色和FISH 检测。细胞块制备技术可将尿脱落细胞离心后经石蜡包埋制成切片，可较清晰显示细胞内部的细微结构，能提高病理诊断的准确性，有研究显示直接涂片相比，细胞块联合常规涂片可使恶性肿瘤的检出率增加6.5%～9.0%［2-4］。细胞蜡块还可以连续切片，同常规石蜡包埋组织一样可运用于免疫组化和分子检测，为病理检测提供额外的诊断信息。

细胞块制备技术是一种将细胞学样本压制成小球并包埋在石蜡块中以进一步加工成组织学标本的技术，常用的方法有直接离心法，血浆凝血酶法和琼脂法等［5］。细胞块制备技术已在多种标本上常规进行，例如胸腹水、细针穿刺等。尿液样本因不具备网络脱落细胞的纤维蛋白，在丢弃上清液后剩余的细胞沉淀很难从离心管底部提取，传统的细胞块技术往往难以获得完全满意的细胞蜡块。我们制备了一种基于特殊基质制作的细胞蜡块，该方法使用专用含基质的离心管，基质在加热到85 ℃后可转化成液态，混入尿液混悬液后，液态基质中的大细胞、高核浆比细胞在离心力的作用下首先分离沉降至最下层，这些细胞往往是病变细胞；在4 ℃中基质又转化为固态作为支架材料，将沉淀的细胞固定在特定的空间位置，再将该区域固态基质切割下来的就形成目标细胞块。该方法操作简单，易于掌握，在一定程度上使细胞块的制作标准化。试剂盒配备两种规格离心管（直径4 和8 mm），可以根据尿液沉渣的体积选择合适的离心管，沉渣多的时候选择直径8 mm的大容量离心管，细胞量少的时候可选择直径4 mm的小离心管。

使用该技术制作的尿液细胞块与常规组织细胞块类似，可连续重复制片，且与常规组织蜡块一样因隔绝空气可长期保存。含有特殊基质的细胞块经常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋切片后HE 染色，镜下显示细胞单层薄片状排列、分布均匀、形态完整、结构清晰、染色强度适宜、背景干净，胞质对比清晰，相较于细胞涂片更容易判读。IHC 检测是一种常用的分子生物学技术，通过使用特定的抗体与组织或细胞中的目标分子相互作用，从而实现对目标分子的定位和定量测定。尿液细胞涂片因不具备常规组织结构的缺点而不易进行IHC 染色定位，而尿液细胞块富集的细胞类似于组织学结构，可以进行IHC 染色。本研究显示尿液细胞块IHC 染色效果较好，染色定位准确，背景干净，对细胞特别是肿瘤细胞的识别更加准确，可以运用于常规病理检测。尿脱落细胞FISH 检测可以检测膀胱癌细胞中3号、7号、17号染色体非整倍性和9 号染色体上P16 基因位点缺失，对尿路上皮癌的早期诊断及复发监测具有重要价值，但传统的尿脱落细胞FISH 检测在尿涂片上检测，常出现细胞重叠或分散的情况，增加了FISH检测的诊断难度。尿液细胞块FISH 切片镜下细胞富集，单层平铺，DAPI 复染示细胞核形态轮廓清晰，荧光红绿信号清晰，背景干净，相对于涂片FISH 染色片，细胞块切片FISH 染色更易进行荧光显微镜下观察分析，不但降低了阅片难度，还缩短了阅片时间。本研究对细胞量较多的21 例尿液细胞块均进行了FISH 检测，其检测结果均与细胞涂片FISH 结果一致，说明尿液细胞块FISH 检测的特异性较高。

虽然尿液细胞块可能是一种与组织学块相似的重要资源，但该技术并不适合所有尿脱落细胞样本。本研究显示在连续送检的36例尿液标本中，制成石蜡块切片后仍有15例仅查见到极少量细胞，经阅片后确认不能满足诊断要求，这一比例率高达41.67%，这些尿液的状态描述往往为黄色清亮液体，离心后沉淀体积往往小于0.05 mL，因此，对细胞量较少的尿液样本不适用于尿液细胞块的制作。此外，与传统涂片细胞学相比，细胞蜡块制作成本高、制作时间长，我们认为细胞块技术不能够成为常规尿脱落细胞检测的替代品，而是其补充。我们的建议是，在筛查尿细胞学样本时应相当有目的地制作细胞蜡块，需结合诊断实际需求和尿液细胞沉淀情况，使患者从细胞块制备中受益最大化。

综上所述，我们成功制备了尿脱落细胞块，且制备的尿脱落细胞块用于HE、IHC 和FISH 检测效果较好。尿液细胞块是较易获得的组织来源，可能成为恶性肿瘤患者组织学分型和基因检测的有效途径。但本研究纳入样本量较少，今后应扩大样本量和检测范围进行更深入的研究。