稳定表达CD19的非小细胞肺癌细胞系的构建

朱帅旗 张帆 詹思建 段海潇 王迪 胡翰 汪洋 刘滨磊

［收稿日期］20211129

［第一作者］朱帅旗（1996-），男，河南商丘人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为生物工程

［通信作者］刘滨磊（1962-），男，湖北武汉人，湖北工业大学教授，研究方向为生物制药

［文章编号］1003-4684（2023）02-0052-05

［摘要］细胞系表达的CD19可被靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）特异性识别。为探究靶向CD19 CAR-T抗肿瘤疗效及机制提供可靠稳定的靶细胞系，运用Lipofectamine 3000TM脂质体转染法将pPBDP-CD19和pSPBT质粒转入A549细胞。嘌呤霉素（Puro）筛选，稳定细胞株A549-CD19单克隆细胞由有限稀释法得到；RT-qPCR鑒定A549-CD19细胞系中CD19 mRNA的表达；流式细胞术检测A549-CD19中CD19的表达；MTS法比较改造前后细胞系的生长活性变化。经Puro抗性筛选和挑取单克隆，得到4个A549-CD19单克隆细胞；RT-qPCR鉴定A549-CD19细胞系均有CD19 mRNA高表达；流式检测单克隆细胞系阳性率均达到99%；MTS法检测发现A549-CD19细胞系与亲本细胞A549细胞具有一致的生长活性。运用PiggyBac转座系统构建稳定表达CD19的A549-CD19细胞系成功，为评估靶向CD19实体瘤CAR-T疗效提供靶细胞，奠定CAR-T细胞抗实体瘤疗效机制研究基础。

［关键词］A549细胞; PiggyBac; CD19; 绿色荧光蛋白

［中图分类号］R153  ［文献标识码］A

人CD19是由胞外N末端、跨膜结构域与胞内C末端组成的跨膜糖蛋白，其大小为95kd，在多数B细胞中极其保守，但在多数慢性和急性B淋巴细胞白血病及B细胞淋巴瘤中过表达[1]。CD19作为关键标记物已被用于白血病、淋巴瘤及免疫疾病的诊断预后评判指标，也为治疗这些疾病提供了靶点[2]。多个靶向CD19的双特异性抗体与CAR-T细胞免疫疗法已在临床试验中取得进展[3，临床实验也证实其良好的疗效，但其在实体瘤组织中的疗效研究较少。据Schmidts A等报道，CAR-T抗实体瘤具有可行性[4]。此外，Chaurasiya S等人发现J2R CAR-T在肺癌模型中具有优异的抗肿瘤活性[5]。新英格兰杂志报道了CAR-T细胞疗法治疗恶性胶质瘤晚期患者案例，经多次输注CAR-T细胞后，患者病症得到完全缓解，这启示了CAR-T疗法在实体瘤具有可行性[6]。

限于CD19大多表达在血液淋巴瘤，而淋巴瘤细胞多存在于病人血液内，为研究CAR-T的抗肿瘤机制带来了不便。而实体瘤细胞具有体外易培养与体内易成瘤的特点，便于评估CAR-T抗实体瘤疗效机制。人非小细胞肺癌A549细胞系作为常用肿瘤研究细胞模型，在肺癌研究中最具代表性[7- 8]，因此本研究拟构建稳定表达CD19的NSCLC细胞系以便于后续CAR-T抗实体瘤疗效机制研究。

此外，用于构建稳转细胞系的常见载体有慢病毒载体和转座子载体，本研究采用的是实验室前期开发的PiggyBac转座质粒系统。本研究使用带有CD19基因的转座质粒和表达转座酶的质粒，将带有CD19基因的转座序列转座至A549细胞染色体上，实现细胞稳转。此外，绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）具有探针的特性，作为报告基因标记特定分子或细胞为科学研究提供极大便利[10]。在本研究中，GFP作为荧光标记，在细胞系筛选、单克隆挑选等步骤起重要作用。

本研究构建稳定表达CD19的A549细胞系，旨在为评估靶向CD19实体瘤CAR-T疗效机制提供理想靶细胞模型。

1    实验材料

从北京协和医院细胞中心获得A549细胞；用DME/F-12（HyClone， USA）培养A549细胞；于浙江天杭生物购买FBS。从Thermo Fisher Scientific购买Lipofectamine3000TM转染试剂盒；PiggyBac Dual Promoter-CD19重组质粒和Super PiggyBac Transposase（pSPBT）转座酶质粒由本实验室改造并保存。无内毒素质粒小提中量试剂盒购于TIANGEN公司。嘌呤霉素（Puro）与MTS分别购于碧云天生物和Promega公司；大肠杆菌DH5α感受态由本团队自主制备。RNA抽提和RNA逆转录试剂盒于TIANGEN和Vazyme购买，SYBR Green荧光染料于TOYOBO公司购买。PE Anti-CD19抗体于Abcam公司购买。流式细胞检测仪（BD）；体视荧光显微镜（Nikon公司）；荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific），多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；北京东联哈尔二级生物安全柜。

2    实验方法

2.1    质粒提取

于-80℃超低温冰箱中取出甘油保存的PiggyBac Dual Promoter-CD19（即pPBDP-CD19质粒菌，由实验室成功构建），将解冻菌液以1∶1000的比例接种至LB液体培养基中，加入Amp使其终浓度为100 μg/mL，37℃，200 r/min摇菌14 h。使用质粒试剂盒提取质粒并测浓度和纯度。

2.2    细胞对嘌呤霉素的敏感性实验

收集A549细胞并离心（500×g， 5 min），离心后重悬细胞并计数。细胞铺24孔板（1.5×105个/孔），于37℃，5% CO2，湿润的培养箱培养12 h。次日于细胞孔中加入梯度浓度的Puro，之后每天观察细胞贴壁百分比并做记录，共计6 d。期间每2d换含Puro的新鲜培养基，在第4天确定A549细胞的最低致死浓度[11]。

2.3    细胞转染

转染前1天，用EDTA-胰酶消化A549细胞，终止消化后收集细胞悬液至离心管，于500×g下离心5 min后弃上清重悬计数。之后调整细胞密度，接种至24孔板，1.5×105个/孔，将细胞放入细胞培养箱过夜培养。第2天当细胞汇合度达到70%～80%时进行质粒转染： 按Lipofectamine3000TM转染试剂说明书以m（pPBDP-CD19-GFP） ∶m（pSPBT）=5∶1的质粒质量比转染A549细胞[12]。用体视荧光显微镜下观察转染48 h后细胞的GFP表达率。

2.4    抗性筛选与A549-CD19单克隆细胞系挑选

A549细胞转染48 h后，按确定的最低致死浓度筛选转染细胞。其间，每2天换一次含Puro的新鲜培养基，待所剩细胞均表达GFP时进行单克隆挑选。将孔板内细胞消化后计数，根据计数的细胞密度进行梯度稀释，稀释密度为500个/mL。96孔板预加100 μL培养基，接种细胞，每孔2 μL细胞悬液。96孔板放入细胞培养箱，24 h后记录单个细胞孔。待细胞克隆形成后于体视荧光显微镜下判断表达GFP情况，筛选出表达GFP细胞克隆并将其扩大培养，依次扩培到24孔板、12孔板、6孔板、T25培养瓶中。

2.5    RT-qPCR检测A549-CD19单克隆细胞系CD19 mRNA的表达

从NCBI数据库获取GAPDH和CD19基因转录mRNA序列并设计SYBR荧光染料定量PCR引物，送基因公司合成备用。分别取A549-CD19、A549细胞铺6孔板，6×105個/孔，培养箱培养过夜。第二天RNA抽提和逆转录试剂盒提取RNA，并将mRNA逆转录cDNA。以cDNA为模板进行相对RT-qPCR，GAPDH作为内参，检测CD19转录水平的相对表达，使用2-ΔΔCt法[ΔΔCt=（Ct样品-Ct GAPDH）-（Ct 对照-Ct GAPDH）]进行数据处理分析[13]。其中CD19的定量引物为：F：ACT-GACCATCATCAAGGA，R：ACCACCGTAGTAATAATGTT；GAPDH的定量引物为：F： CTCTGGTAAAGTGGATATTGT，R： GGTGGAATCATATTGGAACA。

2.6    流式细胞术检测A549-CD19单克隆细胞系CD19的表达

准备约106个的A549-CD19和A549细胞上机进行流式细胞检测，其中A549作为对照细胞。胰酶消化并用完全培养基终止消化，将细胞悬液收集到1.5 mL EP管中，于500×g下离心5 min，弃上清并用PBS重悬细胞。使用PBS清洗细胞1次，最后用500 μL PBS重悬，此时细胞密度约2×106 个/mL。之后加入偶联PE的CD19抗体与细胞避光孵育30 min，孵育完成后使用PBS清洗细胞3次，重悬细胞[14]。细胞悬液经细胞滤网过滤，同时设置流式细胞仪检测通道为GFP和PE双通道、设置细胞上样的上限数为5×105个。最后将细胞悬液上机检测，收集数据。PE的相对荧光强度作为CD19表达的量化指标。

2.7    MTS法检测A549-CD19细胞系增殖活性

选取表达较高的A549-CD19-3细胞系进行增殖活性测定。取一定量的A549与A549-CD19-3细胞，计数后铺96孔板，每个孔板接种对应细胞悬液100 μL（2×104个），每种细胞三个复孔，铺5块96孔板。培养过夜按0  h计，分别于0，24，48，72，96 h后测定细胞活性。MTS检测步骤如下：于空白培养基和细胞所在孔中分别加入MTS溶液20 μL，包裹锡纸于细胞培养箱中避光孵育4 h。4 h后多功能酶标仪待测样品孔490 nm波长下的吸光度。

3    实验结果

3.1    A549-CD19细胞系构建

pPBDP-CD19-GFP质粒构建如图1所示。其中CD19 cDNA全长1671 bp，并且受上游CMV启动子转录调控。抗性基因PuroR和标记基因GFP之间通过T2A序列连接并受EF1α启动子调控。

3.2    A549细胞对嘌呤霉素敏感性分析

图2展示的是A549细胞在Puro（1～10 μg/mL）作用下的致死曲线。结果表明，经Puro处理4 d后，4 μg/mL的剂量即可观察到细胞完全死亡，因此后续筛选转染细胞的浓度确定为4 μg/mL。

3.3    pPBDP-CD19与pSPBT质粒共转A549细胞

pPBDP-CD19转座载体质粒与pSPBT辅助质粒转染A549细胞48 h后，于体视荧光显微镜蓝色激发光下可以观察到GFP的表达，表明质粒转染表达且效率在30%左右（图3）。

3.4    A549-CD19细胞单克隆挑选

经过Puro抗性筛和单克隆细胞挑选并将细胞培养4 d后，得到4个表达GFP的A549-CD19单克隆细胞团。图4是于荧光显微镜明场和暗场下拍摄的结果。

3.5    CD19 mRNA在A549-CD19细胞系中高表达

收集单克隆细胞系并对其CD19 mRNA的转录进行荧光相对定量。如图5所示，4个A549-CD19单克隆细胞系相较于A549细胞有2000多倍的表达，表明CD19 mRNA在A549-CD19单克隆细胞系中高表达。

3.6    CD19在A549-CD19細胞系中具有高表达

以A549细胞作为对照，流式细胞术检测A549-CD19单克隆细胞系的纯度及CD19在细胞膜上的表达。如图6a所示，4个单克隆细胞系的GFP与PE-CD19的双阳率均高于99%，表明A549-CD19细胞系的纯度很高。另外，通过PE-CD19单通道的平均荧光强度即MFI判断CD19的表达情况（图6b），CD19-PE的MFI均达到99.9%，表明CD19在A549-CD19细胞系中的表达丰度很高。综上，A549-CD19细胞系构建成功。

3.7    A549-CD19细胞系具有与亲本A549细胞一致的生长活性

从A549-CD19-2和A549-CD19-3两个细胞系中随机选取A549-CD19-3单克隆细胞系进行增殖活性比较。如图7所示，根据MTS溶液加入细胞4 h后的490nm处吸光度值显示，A549-CD19-3细胞系在0、24、48、72、96 h时间点的吸光度值与亲本细胞的吸光度值差异无显著统计学意义（P＞0.5），CD19的表达对细胞增殖活性基本无影响。

4    结论与讨论

运用LipofectamineTM 3000转染试剂共转pPBDP-CD19质粒与pSPBT质粒至A549细胞中，构建了表达CD19的人非小细胞肺癌单克隆细胞系即A549-CD19，而后运用RT-qPCR和流式细胞术成功检测到CD19的转录表达。

B细胞抗原受体CD19作为膜上免疫球蛋白共受体的重要一员，在B细胞的各生长阶段基本都表达，在大多急性/慢性B淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤上可以鉴定。这些特性决定了CD19是抗B淋巴恶性肿瘤CAR-T治疗的最佳靶点。根据已有报道，CD19 CAR-T细胞具有靶向CD19+肿瘤细胞的特异、有效且持久的杀伤效果[15]。因此，通过建立稳定表达CD19的人肺癌A549细胞系（即A549-CD19）为后续评估CAR-T抗实体瘤疗效及机制研究提供理想的靶细胞系。PiggyBac作为高效的转座子系统之一，长期被用于体细胞诱导多能干细胞工程，而且不改变原基因的结构和功能，可以为人T淋巴细胞提供持续的转基因表达[16]。因此，使用PiggyBac转座子系统作为稳定遗传修饰的技术平台，将pPBDP-CD19质粒与pSPBT质粒导入A549细胞，根据转染后成功表达CD19的细胞对嘌呤霉素的抗性筛选阳性细胞。选择表达CD19的单克隆细胞建立A549-CD19细胞系；转录水平的RT-qPCR反应和蛋白水平的流式细胞术检测证实CD19整合到A549基因组中并成功转录表达。根据MTS生长活性差异性比较，A549-CD19细胞系表现出与亲本细胞一致的生长增殖活性。

总之，在此构建的单克隆A549-CD19细胞系不仅为体外评估CD19-CAR改造T细胞抗实体瘤疗效机制研究提供了靶细胞，同时也为后续CAR-T在动物模型体内浸润对抗实体瘤疗效研究奠定了基础。

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Construction of A549 Cell Line Stably Expressing CD19 Using PiggyBac System

ZHU Shuaiqi， ZHANG Fan， ZHAN Sijian， DUAN Haixiao， WANG Di， HU Han， WANG Yang， LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food Science， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China）

Abstract：Objective： Non-small cell lung cancer （NSCLC） A549-CD19 cell line stably expressing CD19 was constructed by  PiggyBac transposon system. The CD19 expressed by the cell line can be specifically recognized and bound by the chimeric antigen receptor （CAR） targeting CD19，providing a reliable and stable target cell line for exploring the anti-tumor efficacy and mechanism of the targeting CD19 CAR-T. Methods： pPBDP-CD19 and pSPBT plasmids were transferred into A549 cells by Lipofectamine 3000TM liposome transfection， stable cell lines were screened by puromycin （Puro）， A549 CD19 monoclonal cells were obtained by limited dilution method， the expression of CD19 mRNA in A549 CD19 cell line was identified by RT qPCR， the expression of CD19 in A549 CD19 was detected by flow cytometry， and the growth activity of cell line before and after modification was compared by MTS method. Results： After Puro resistance screening and selection of clones， four A549 CD19 monoclonal cells were obtained; all A549 CD19 cell lines were identified by RT qPCR to have high expression of CD19 mRNA; flow detection showed that the positive rate of monoclonal cell lines reached 99% MTS method. It was found that the growth and viability of A549 CD19 cell line was consistent with that of parent cell A549.Conclusion： The A549 CD19 cell line stably expressing CD19 is successfully constructed， which provides target cells for evaluating the efficacy of CAR T targeting CD19 solid tumor， and lays the foundation for the study of the mechanism of CD19 CAR T cell anti-solid tumor effect.

Keywords： A549 cell;  PiggyBac; CD19; Green fluorescent protein

［責任编校： 张众］