芽孢杆菌BC4铬抗性相关基因chrA的克隆表达

苍岩　陈旭　冉钟吕　蔡亚君

摘 要：以芽孢杆菌BC4菌株为对象，通过对其铬抗性相关基因chrA的克隆表达来测定其编码蛋白ChrA还原Cr（VI）的能力以及该蛋白在芽孢杆菌Cr（VI）去除中的作用，可帮助进一步阐明芽孢杆菌与Cr（VI）的作用机理，并为芽孢杆菌应用于铬污染治理奠定理论基础。PCR扩增出芽孢杆菌BC4菌株铬抗性相关基因chrA，PCR产物经克隆与测序，得到chrA完整的DNA序列。该序列大小为1182bp，共编码393个氨基酸，预测编码蛋白分子量为43kDa。根据利用NCBI所进行的BLAST序列比对结果，判断该基因为铬转运蛋白编码基因。将chrA基因PCR产物双酶切后连接到表达载体pET28b并转化进大肠杆菌BL21中，对其表达产物进行分析。结果表明，chrA基因在大肠杆菌BL21中表达约43kDa的蛋白，与预期结果相符；重组菌株对Cr（VI）的耐受能力高于对照菌株，说明ChrA蛋白在芽孢杆菌BC4的Cr（VI）抗性机制中起重要作用，且重组菌株对Cr（VI）具备较强的抗性。

关键词：芽孢杆菌；chrA基因；基因克隆与表达；重组菌株

中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：2095－414X（2023）05－0025－06

0引言

Cr（VI）是一种极强的氧化物质，在接触到有机体时，会引起强烈的腐蚀性，对生物造成损害：Cr（VI）可通过消化道、呼吸道、皮肤及鼻粘膜进入人体，在肝脏、肾脏、内分泌腺等器官中积累，危害人体健康[1]；高浓度的Cr（VI）会抑制植物生长，导致叶片黄化和坏死[2]。Cr（VI）的毒性约是Cr（III）的100倍[3]，Cr（III）在土壤、水环境中均有分布，是人体必需的痕量饮食营养元素，相对Cr（VI）毒性较低。因此，对铬污染的治理通常通过将Cr（VI）还原为Cr（III）以消除或减轻其危害。

目前有关Cr（VI）污染的治理方法主要有化学、物理、生物修复３种，其中化学还原[3]、吸附[5]、反渗透[6]、电化学[7-8]等方法处理价格昂贵，不能完全将重金属去除，且试剂消耗高，会产生有毒污泥而造成二次污染。因此，这些方法还不适宜处理低浓度Cr（VI）污染[9]。与传统的物理化学方法正好相反，生物修复方法的优点是能量和材料要求低，且无二次污染，这使得该方法更经济、环保和安全。

在几种可行的方法中，耐铬菌将Cr（VI）生物转化为相对无毒的Cr（III）具有投资少、操作方便、不产生二次污染的优点，其已逐渐发展为一种便宜又方便，处理也十分彻底的方法。微生物对于Cr（VI）的作用机制主要有还原机制和抗性机制[10]。大量研究已分离出可高效去除Cr（VI）的微生物，但微生物对Cr（VI）抗性机制仍不清楚，大多研究都是菌种的分离和去除特性的探究方向[12]，对于微生物的Cr（VI）抗性机制以及相关基因的编码蛋白还需要进一步探究。

本研究前期从土壤中筛选分离得到一株对Cr（VI）具有较强还原和耐受能力的细菌，初步鉴定为蜡样芽胞杆菌，为探明该菌对铬的抗性和还原机制，本研究對芽孢杆菌BC4的一个chrA基因进行了克隆和表达，首先将chrA基因进行PCR扩增，然后以pET28b为表达载体，将chrA基因连接到pET28b上进行重组质粒的构建，然后筛选正确的重组质粒将其导入受体细胞E.coli BL21中，再将其进行Cr（VI）诱导表达。通过比较重组菌株和对照菌株胞内粗提物的Cr（VI）耐受能力，分析chrA基因编码蛋白的功能，并成功构建了ChrA重组菌株。重组菌株对Cr（VI）具备较强的抗性能力，通过铬还原菌对Cr（VI）抗性机制的研究，可为微生物应用于治理环境铬污染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

芽孢杆菌BC4为本实验室分离所得。表达载体pET-28b和感受态细胞E.coli BL21由实验室-80℃超低温冰箱内保存。

1.2 菌种与质粒

质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、2×Taq Master Mix酶、6×DNA loading buffer、BM2000 DNA Marker、1KB DNA Ladder均购自大连宝生物工程公司，BamHI、SalI限制性内切酶，T4 DNA连接酶，均购自Sigma公司；琼脂糖（Biowest公司），LB培养基（每升含10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，固体培养基另添加2%琼脂），卡那霉素使用浓度为50ug/mL；鼠抗His-tag稀释液（一抗：封闭液为1∶2000，4℃保存，可短期内重复利用三次），羊抗鼠IgG-HRP稀释液（二抗：封闭液为1∶5000，4℃保存，可短期内重复利用三次），抗体均购自武汉亚科因生物技术有限公司，其余均为国产或进口分析纯试剂。

1.3 细菌裂解液模板的制备和质粒的提取

将活化后的芽孢杆菌BC4菌液划线接种到含有LB培养基固体平板上，在培养箱内（37℃）倒置培养12h，挑取菌落于无菌水中，震荡悬浮至菌体全部分散，在沸水中水浴10min，立刻冰浴。离心取上清，即得PCR扩增所用菌裂解液模板[13]。质粒的提取按照质粒小提试剂盒说明书操作。

1.4 芽孢杆菌chrA基因的克隆

根据NCBI数据库中chrA基因同源序列，利用软件Primer Premier5设计引物：

ChrA-F：CGGGATCCCGTTGGAAAATAACAAATAC（引入BamHI酶切位点）

ChrA-R：GTCGACTTACAAAATGGATAGAATATATCCGC（引入SalI酶切位点）

引物由武汉科迈欣生物科技有限公司合成。以提取的芽孢杆菌BC4的DNA为模板，ChrA-F、ChrA-R分别为上、下游引物，2×PCR Master Mix酶扩增chrA基因。PCR扩增反应体系及程序如表1所示，1%琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物，并对正确PCR产物进行DNA提纯试剂盒提纯回收。

1.5 感受态细胞的制备

感受态细胞的制备方法参考《分子克隆实验指南》第三版（2002）[14]方法进行。

1.6 基因表达载体的构建

用T4连接酶将纯化产物进行连接，将双酶切后的目的基因片段及表达载体 pET28a双酶切产物连接，根据载体和目的片段的大小和摩尔比确定二者的使用量，计算得到的连接体系（25μl）：2.5μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，20.5μL DNA，1μL载体质粒，1μL T4 DNA Ligase。4℃条件下反应72h。

连接完成后，65℃水浴加热10min使连接酶失活。将全量25μL连接产物加入200μL E. coli BL21感受态细胞中混合均匀，冰置30min。在42℃恒温水浴中加热90s，即刻冰浴2min；加入890μL于37℃预热过的LB液体培养基，混匀后，37℃，120rpm振荡培养3h。取350μL培养产物于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，缓慢晃动使液体培养物均匀分布在培养基表面，待晾干后置于37℃恒温培养箱培养。

培养16h后观察平板菌落生长状况，挑选单菌落接种至装有5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基试管内，过夜培养后取菌液提质粒并采用BamHI/SalI双酶切进行目的基因验证。

鉴定正确的质粒即为chrA基因在质粒pET28a T7启动子控制下表达的重组质粒，将其命名为pETChrA，重组菌株命名为E-pETChrA。

1.7 重组菌株的蛋白表达

将鉴定正确的重组菌株E-pETChrA转接到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，120rpm条件下震荡培养过夜，2％接种量转接至100mL的新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，当培养至OD600约0.6时，加入终浓度为40mg/L的Cr（VI）诱导过夜培养，同时诱导空载体转化菌株作为空白对照。12000rpm离心1min，收集菌体。

1.8 表达产物的SDS-PAGE及Western-blot检测

取15?L的4×Protein SDS-PAGE loading buffer和45?L的纯化蛋白混合后，沸水浴10min，8000rpm、4℃下离心1min得到蛋白胶样品。蛋白质电泳使用的分离胶浓度为10%、积层胶浓度为5%。具体配方如表2所示，分别吸取上述溶液添加至50mL小烧杯中，轻柔且迅速地摇晃烧杯10s使其混合均匀，此步骤的目的是使丙烯酰胺能够快

速聚合，再在两个玻璃板中间缓慢添加液态凝胶，向凝胶上添加适量无菌水至液面与玻璃板齐平，使凝胶表层无气泡，将制胶装放于35℃的恒温箱中，等待30min，待凝胶聚合结束后，滤纸条将其上无菌水吸干。将5%积层胶（3mL体系）添加至50mL小烧杯中，轻柔且迅速地摇晃烧杯10s使其混合均匀，在凝胶填充前插入一个规格为0.75mm的梳子，添加凝胶后，将制胶装置放于35℃恒温箱，等待30min。

取預染Marker3?L、煮沸离心后的蛋白胶样品10?L，分别在孔内点样，连接蛋白质电泳装置，设置恒定电压100V，接通电源进行电泳，待样品跑到下端终止跑胶，时长约2-2.5h，根据每次的跑胶速度适当调整。跑胶结束后用超纯水清洗，然后用染色液染色20min，超纯水洗去浮色后再用脱色液脱色两次，每次15min，上述步骤均在室温的摇床内操作，转速调至60rpm，脱色结束后将蛋白胶过夜浸泡在7%冰醋酸中脱去底色，拍照记录并观察。

Western-blot具体操作为：SDS-PAGE电泳结束后未染色的凝胶切下实验所需部分，将三层滤纸、PVDF膜、蛋白胶、三层滤纸依次放置于转膜装置中，加入电转液，接通电源，电压20V，电流60mA，转膜1.5h至PVDF膜上；转膜完成后在摇床里进行TBST（2.4gTris-base，8.7gNaCl，再加入1ml TWEEN-20，加入超纯水至1L容量瓶刻度线，调节pH为7.5，灭菌后使用，4℃保存）洗膜两次各10min，室温、60rpm；洗膜后用封闭液（1g脱脂奶粉溶于20mL无菌的TBST中）封闭2h；后续实验步骤均在在4℃低温环境下；封闭结束后用TBST洗膜三次各10min；再将清洗过的膜放入鼠抗His-tag稀释液（一抗，1∶2000）中孵育过夜，孵育完成再用TBST洗膜三次各10min，再放入羊抗鼠IgG-HRP（二抗，1∶5000）中孵育1h，然后用TBST洗膜两次各10min；最后利用DAB显色试剂盒进行结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测，

观察出现条带后立刻用无菌水冲洗显色剂，终止显色反应并拍照。

1.9 重组菌株的Cr（VI）抗性检测

为了检测重组菌株E-pETChrA的Cr（VI）抗性是否增强，应用平板划线法将重组菌株E-pETChrA和对照菌株E-pET28b分别在固体培养基平板上接种，其中卡那霉素的浓度为50?g/mL，37℃恒温培养箱倒置培养12h；挑单菌落至5mL含50?g/mL卡那霉素的LB培养基中活化，其中一组重组菌株E-pETChrA加入50mg/L的无菌Cr（VI）溶液进行诱导表达，其他组不做特殊处理，37℃，120rpm条件下培养24h；将重组菌株及对照菌株的分别按照2%接种量分别转接至装有100mL含不同浓度Cr（VI）（0、30、50、80、100、130、160、200、240mg/L）的液体培养基锥形瓶中（体系内卡那霉素的浓度为50?g/mL），培养24h后测定其OD600，绘制菌株在不同浓度Cr（VI）培养条件下生长情况图。每组设置三个平行。

2结果

2.1 PCR产物的电泳结果

以芽孢杆菌BC4基因为PCR模板，扩增出的PCR产物电泳结果见图1。由上述PCR产物的电泳图片可知得到的PCR产物大小约1200bp，与chrA基因（1182bp）大小一致，说明PCR成功扩增出了chrA基因DNA。

2.2 芽孢杆菌chrA基因编码蛋白氨基酸序列分析

经全基因组测序，得到ChrA的氨基酸序列如下：

MENNKYTFHTLLEIFLVSFKLGITSFGGPVAHLGYFHHEYVEKRKWMDERIYGDLVALCQFLPGPASSQVGMGVGLLRGGVFGAIISWIGFTLPSVLVLVFFASFLNQFDLGSAGWIHGLKLVAVAIVAHAIWGMAQKLTPDRNRATIAIATASIALLWPSSWTQVTLIIISGFIGWLLYRNEPISQSQHIKVPISKNIAVSCLVLFFGLLLLLPILRPFSYYIALFDSFYRSGALVFGGGHVVLPLLEGEFVQNGMMTKEQFLAGYGLTQAMPGPLFTFASYIGAVLNGTLGAILATIAIFLPAFLLVIGVLPFWDSVRKISFIQGALLGVNAAVVGILLAAFYDPIWTSTIMNAVDFVFASLLFCLLAFWKTPPWVIVILGAFGGYILSIL

由上可以得知chrA基因可以编码393个氨基酸，其理论分子量约为43kDa。

将氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST序列比对，并构建进化树，结果见图2。

由图2可知，与chrA基因编码的氨基酸序列同源性最高的是Bacillus cereus菌株chromate transporter WP000429767.1，同源性最高为99.75%，基本可判断chrA基因编码的蛋白属于铬酸盐转运蛋白，该类蛋白可将进入细胞的铬迅速转运至细胞[15]，从而提高铬还原菌对铬酸盐的耐受性。

2.3 重组表达菌株的鉴定

大量活化含表达载体质粒的菌株E-pETChrA并提取质粒，将质粒均用BamHI/SalI双酶切后胶回收其酶切产物，电泳检测结果见图3，琼脂糖凝胶电泳结果显示：泳道2表示酶切后形成的2个DNA片段条带，大小分别约为5300bp和1200bp，与pET28b质粒理论长度5369bp以及chrA基因理论长度1182bp十分接近，可初步定性认为成功构建重组质粒。

2.4 表达产物的SDS-PAGE电泳分析及Western-blot检测

分别在含有卡那霉素的LB培养基中活化培养对照菌株E-pET28b和重组菌株E-pETChrA，培养得到的菌液各取1mL离心后弃上清，菌体用60?L ddH2O悬浮混匀，加入4loading buffer混合均匀后沸水浴10min后自然冷却，离心取上清。取预染marker 5?L、处理得到的蛋白胶样品各10?L点样，进行SDS-PAGE电泳，结果见图4，预测蛋白的分子量与SDS-PAGE胶上的蛋白大小一致，为43kDa；经Western-blot鉴定上述特异性条带为重组菌株所表达的目的蛋白。

3、6：E-pETChrA）

2.5 重组表达菌株的表达产物活性分析

分别测定重组菌株E-pETChrA和对照菌株E-pET28b在含不同浓度Cr（VI）（0、30、50、80、100、130、160、200、240mg/L）的LB液体培养基中的抗Cr（VI）能力。由图5可知重组菌株具有一定的Cr（VI）的抗性能力，其最高能耐受130mg/L的Cr（VI），即重组菌株E-pETChrA的抗Cr（VI）生长能力显著高于对照菌株E-pET28b。即ChrA蛋白的表达赋予了大肠杆菌更高的Cr（VI）耐受能力。

Cr（VI）抗性同样在不诱导和经过50mg/LCr（VI）诱导两种条件下测得。初始菌液浓度基本保持一致，随着培养基中Cr（VI）含量的增加，经过Cr（VI）诱导的E-pETChrA菌液浓度明显高于未经诱导的菌株。经过Cr（VI）诱导的E-pETChrA对Cr（VI）的最大耐受能力为130mg/L，而未经过Cr（VI）诱导菌株在30mg/LCr（VI）环境下很难存活下去，OD600均未达到0.2。

3结论

本文以一株具有Cr（VI）还原能力的细菌为对象，经基因组测序鉴定其为芽孢杆菌属，命名为BC4，对其铬抗性相关基因chrA的克隆及表达进行了研究。PCR扩增出chrA基因，经克隆与测序得到chrA完整的DNA序列。该序列大小为1182bp，编码393个氨基酸，预测编码蛋白分子量为43kDa。通过NCBI进行BLAST序列比对，构建其系统发育树，判断该基因为铬转运蛋白编码基因。将chrA基因PCR产物扩增进行双酶切后连接到表达载体pET28b并转化进感受态细胞BL21中，对其表达产物进行分析。结果表明，chrA基因在大肠杆菌BL21中表达的蛋白约43kDa，与预期结果相符；重组菌株对Cr（VI）的耐受能力远高于对照菌株，最高能耐受100mg/L的Cr（VI），说明ChrA蛋白在芽孢杆菌BC4的Cr（VI）抗性机制中起重要作用，重组菌株对Cr（VI）具备较强的抗性。该研究为将来将基因工程菌和Cr（VI）抗性基因在Cr（VI）污染土壤或水中的应用奠定基础，因此，该技术的发展具有十分重要的意义。

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Clonal Expression of Bacillus Cereus BC4 Chromium resistance-associated gene chrA

CANG Yana， CHEN Xua， RAN Zhong-lva，CAI Ya-juna，b

（a.School of Environmental Engineering;b.Engineering Research Center for Clean Production of Textile Dyeing and Printing，

Wuhan Textile University， Wuhan Hubei 430200， China）

Abstract：In this paper， Bacillussp. BC4 strain was used as the target， and its chromium resistance-related gene chrA was cloned and expressed to determine the ability of its encoded protein ChrA to reduce Cr（VI） and the role of this protein in the removal of Cr（VI） by Bacillus， which can help to further elucidate the mechanism of Bacillus and Cr（VI） and lay the theoretical foundation for the application of Bacillus to chromium pollution treatment. The PCR amplified the chromium resistance-related gene chrA of Bacillusstrain BC4， and the PCR product was cloned and sequenced to obtain the complete DNA sequence of chrA. The sequence size was 1182bp， encoding 393 amino acids， and the predicted molecular weight of the encoded protein was 43kDa. The expression product was analyzed by double digestion of the chrA gene PCR product and ligated into the expression vector pET28b and transformed into E. coli BL21. The results showed that the chrA gene expressed about 43kDa protein in E. coli BL21， which was consistent with the expected results; the tolerance ability of the recombinant strain to Cr（VI） was higher than that of the control strain， indicating that the ChrA protein played an important role in the Cr（VI） resistance mechanism of Bacillus BC4， and the recombinant strain possessed a strong resistance to Cr（VI）.

Keywords：Bacillus cereus; chrA gene; Gene cloning and expression; Recombinant strain

（責任编辑：周莉）

*通讯作者：蔡亚君（1980-），女，副教授，博士，研究方向：环境中重金属的钝化修复及其生态效应.