唐宇雁, 谢仕斌, 朱建芸
中山大学附属第三医院感染科, 广州 510635
原发性肝癌,是世界上第6位常见恶性肿瘤,第3位恶性肿瘤致死病因,在我国,居恶性肿瘤的第5位及第2 位恶性肿瘤致死病因[1]。目前,我国肝癌患者年龄标化后的总体5 年生存率仅有14.1%[2],而BCLC 0 期和A 期患者通过根治性治疗,5 年生存率可达69%~86.2%[3]。故提高肝癌的早期检出率尤为重要及迫切。
目前,国内外均推荐对肝细胞癌(HCC)高危人群进行每6个月1次的超声(US)+血清甲胎蛋白(AFP)筛查[4-5]。但US 对早期肝癌的诊断灵敏度仅有45%~47%[6],AFP作为临床上运用最广泛的肝癌标志物,其诊断早期肝癌的灵敏度和特异度尚不能令人满意。含有不同糖基的AFP 亚型与扁豆凝集素亲和力不同,其中,AFP异质体L3(AFP-L3)与扁豆凝集素亲和力最高,主要由恶性肝细胞产生[7],具有较高的特异度,目前临床上主要以AFP-L3 占总AFP 的比例(AFP-L3%)作为肝癌诊断指标,但关于AFP 及AFP-L3%的最佳截断值尚存在争议。符合中国国情的中国肝癌分期(China liver cancer staging,CNLC)中早期肝癌主要包括Ⅰa期(单个肿瘤且直径≤5 cm)、Ⅰb期(单个肿瘤且直径>5 cm 或者2~3 个肿瘤且最大直径≤3 cm)、Ⅱa 期(2~3 个肿瘤且最大直径>3 cm),相比BCLC 分期,CNLC 分期对于肝癌的根治性治疗条件放宽,建议CNLC 分期中的Ⅱa 期可行根治性治疗[8],而BCLC 分期中则将此部分患者纳入B 期,建议行化疗栓塞术。既往关于AFP-L3%的肝癌研究大多基于BCLC、TNM分期等国外肝癌分期,尚缺乏其在CNLC 早期HBV 相关HCC 中的诊断效能分析。本研究以HBV 相关肝病为研究对象,旨在研究AFP 和AFP-L3%在早期肝癌中的诊断效能及其最佳截断值,以期为临床医生早期发现肝癌、选择更优化的治疗方案提供参考。
1.1 研究对象
1.1.1 入组情况 纳入2019年1月—2022年7月于本院就诊的慢性乙型肝炎患者346例(CHB组)和HBV相关肝硬化患者293 例(LC 组)作为对照组(CHB 组+LC组),其中包括597 例ALT 正常对照组;HBV 相关HCC患者1 080例(HCC组)(其中CNLCⅠa期419例,Ⅰb期132例,Ⅱa期69例,Ⅲ~Ⅳ期460例;ALT正常HCC患者598例,ALT升高HCC患者482例)。
1.1.2 纳入标准 (1)年龄18~85 岁;(2)HBsAg 阳性的同时,CHB、LC、HCC 诊断标准分别符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019 年版)》[9]、《肝硬化诊治指南》[10]、《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[8];(3)ALT正常组肝癌的ALT 水平≤35 U/L;(4)肝癌患者为初次诊断且尚未接受治疗;(5)临床资料完整。
1.1.3 排除标准 (1)合并其他原因引起的慢性肝病,如其他嗜肝病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病等;(2)合并其他肿瘤;(3)妊娠或哺乳期妇女;(4)合并HIV感染或其他免疫缺陷性疾病;(5)就诊时正在服用华法林或维生素K治疗。
1.2 研究方法
1.2.1 观察指标 (1)一般资料:年龄、性别、肝性脑病分期;(2)影像学资料:通过浏览患者就诊期间的上腹部CT/MRI动态增强扫描或超声造影等影像学结果,收集肝癌患者的腹水、肿块个数、肿块直径、门静脉系统癌栓、肝外转移情况;通过US/CT/MRI 收集良性肝病患者的腹水、肝炎或肝硬化情况;(3)实验室指标:ALT、Alb、PT、TBil、AFP、AFP-L3、AFP-L3%;(4)通过Alb、TBil、PT、腹水、肝性脑病分期评估Child-Pugh 肝功能分级。
1.2.2 研究指标检测方法 AFP 和AFP-L3 的检测采用磁微粒化学发光免疫分析法(北京热景生物技术股份有限公司),计算AFP-L3%。当AFP 水平较低时,AFP和AFP-L3检测不出,患者血液检测报告显示:AFP<0.6 ng/mL,AFP-L3<0.6 ng/mL,AFP-L3%<5%,此时AFP直接取值0.6 ng/mL,AFP-L3 取值0.6 ng/mL,AFP-L3%取值5%。联合检测时,若有一项大于最佳截断值,则判断为阳性。
1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0、MedCalc 15.2.2和R语言4.1.3软件分析数据。偏态分布计量资料采用M(P25~P75)描述,两组间比较采用Mann-WhitneyU检验,多组间比较采用Kruskal-WallisH检验,进一步两两比较采用Bonferroni 法。计数资料组间比较采用χ2检验。计算敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数、Kappa值、最佳截断值、受试者工作特征曲线下面积(AUC),AUC 之间的比较采用Delong 检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 临床基线特征分析 CHB 组、LC 组、HCC 组3 组间的年龄、性别、HBeAg 阳性率、HBV DNA≥100 IU/mL比率、ALT 水平、Child-Pugh 分级的差异均有统计学意义(P值均<0.05)。HCC 组AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平均高于CHB组和LC组(P值均<0.001)(表1)。
表1 3组患者临床基线特点及AFP、AFP-L3、AFP-L3%的比较Table 1 Comparison of clinical baseline characteristics and distribution of AFP, AFP-L3 and AFP-L3% in three groups
2.2 对照组(CHB组+LC组)与早期HCC组(Ⅰa~Ⅱa期)的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比较 与对照组相比,早期HCC 组的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平均高于对照组(P值均<0.001)(表2)。
表2 对照组与早期HCC组AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比较Table 2 Comparison of AFP, AFP-L3 and AFP-L3% levels between the control group and the early stage HCC
2.3 ALT 正常的对照组(CHB 组+LC 组)与ALT 正常HCC 组、不同ALT 水平HCC 组的AFP、AFP-L3、AFPL3%水平比较 与ALT 正常的对照组相比,ALT 正常的HCC 组的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平均升高(P值均<0.001)(表3);与ALT 正常的HCC 组相比,ALT 升高的HCC 组的AFP 水平更高(P<0.01),而两组之间的AFP-L3%和AFP-L3 水平差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表4)。
表3 ALT正常对照组与ALT正常HCC组的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比较Table 3 Comparison of AFP, AFP-L3 and AFP-L3% levels between the control group with normal ALT and the HCC group with normal ALT
表4 不同ALT水平的HCC组的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比较Table 4 Comparison of AFP, AFP-L3 and AFP-L3% levels among HCC groups with different ALT levels
2.4 AFP、AFP-L3%在总体HCC 中的诊断效能分析在总体HCC 中,AFP 和AFP-L3%的最佳截断值分别为8.5 ng/mL 和5%,均获得良好的AUC(图1);AFP 和AFP+AFP-L3%间的AUC差异无统计学意义(Z=0.571,P=0.568),但高于单用AFP-L3%时(AFP vs AFP-L3%和AFP+AFP-L3% vs AFP-L3%的AUC 比较,Z分别为9.329 和10.303,P值均<0.001),单用AFP 敏感度和特异度分别为70.4%、85.0%。(表5)。
图1 AFP、AFP-L3%单独及联合诊断总体HCC的ROC曲线Figure 1 ROC curve of AFP, AFP-L3% alone and combined about the diagnosis of total HCC
表5 AFP、AFP-L3%在总体HCC中的诊断效能分析Table 5 Analysis of the diagnostic efficacy of AFP and AFP-L3% in overall HCC
2.5 AFP、AFP-L3%在早期HCC(Ⅰa~Ⅱa期)中的诊断性能分析及不同截断值比较 在早期HCC 中,AFP和AFP-L3%最佳截断值分别是8.7%和5%,AFP 及AFP+AFP-L3% 的AUC 值 均 高 于AFP-L3%(AFP vs AFP-L3%:Z=8.173,P<0.001;AFP+AFP-3% vs AFPL3%:Z=8.802,P<0.001),但单用AFP 或者联用AFPL3%的AUC 比较,差异无统计学意义(Z=0.609,P=0.543);对比既往学者及指南推荐的截断值(AFP分别取20、200、400 ng/mL;AFP-L3% 分别取10%、15%),不管是单用AFP、AFP-L3%还是两者联用,本研究所得截断值的敏感度、Kappa 值及阴性预测值均最高;单独使用AFP敏感度和特异度可达66.9%和85.1%;联用AFP-L3%并没有明显提高敏感度和AUC(表6,图2)。
图2 AFP、AFP-L3%单独及联合诊断早期HCC的ROC曲线Figure 2 ROC curve of AFP, AFP-L3% alone and combined about diagnosis of CNLC early stage HCC
表6 AFP、AFP-L3%在早期HCC中的诊断性能及截断值比较Table 6 Diagnostic performance analysis of AFP and AFP-L3% in early stage HCC and comparison of different cut-off points
AFP 可以刺激肝癌细胞系的细胞增殖、细胞运动和侵袭,通过阻断AFP 可以实现癌细胞的凋亡[11-12]。Meta 分析[6,13]显示,AFP 联合US,在总体肝癌中可将US敏感度从78%提升至97%,在早期HCC中,可将US敏感度从45%~51.6%提升至63%~74.1%,并保留83.9%的特异度。AFP-L3%作为另一监测HCC 的血清标志物,具有高特异度和低敏感度特点。Meta 分析[14]显示,AFP-L3%诊断肝癌的敏感度仅0.483,特异度高达0.929。AFP-L3%在早期HCC 中的敏感度和特异度分别为34%和92%[15]。此外,在AFP 低滴度肝癌患者中可见AFP-L3 水平异常[16-17],且ALT 水平的升高与AFP-L3无关[18],相对单独AFP监测,联合AFP-L3%可明显提高早期HCC 的检出率[19]。可见,AFP-L3%可作为重要的补充性肝癌筛查指标。
由于研究对象、研究类型、检测方法不同,目前关于AFP 和AFP-L3%诊断HCC 的截断值尚有争议。Choi等[19]发现,在LC和CHB患者的随访中,AFP-L3使用高灵敏的“毛细管电泳芯片法”,AFP 和AFP-L3%的最佳截断值分别为5 ng/mL 和4%,且二者联合诊断HCC效能最佳,敏感度和特异度分别为79%和87%,并且AFP+AFP-L3%+US 联合检查的敏感度可达94.3%,明显优于AFP 联合US。Lok 等[20]发现,在丙型肝炎患者长期使用抗病毒药物治疗随访中,当AFP 截断值取20 ng/mL 时,总体HCC 敏感度和特异度分别为61%和81%;当截断值取200 ng/mL 时,敏感度下降至22%,伴随特异度升至100%。Marrero 等[21]的多中心病例对照研究发现,在纳入了包括HBV、HCV、酒精等导致的BCLC 早期HCC 中,AFP 最佳截断值为10.9 ng/mL,敏感度为66%,并且保留82%的特异度,AFP-L3%最佳截断值为1.7%,敏感度和特异度分别为37%和94%;国内外权威肝癌指南关于AFP 和AFP-L3%的截断值推荐也各不相同。日本肝病学会建议在监测和诊断肝癌时将AFP 和AFP-L3%截断值取10 ng/mL 和10%[22],美国食品药品监督管理局建议将AFP-L3%≥10%作为诊断截断值。而我国原发性肝癌诊疗指南[8]建议在排除了良性肝病等情况后,AFP≥400 μg/L高度提示肝癌,尚未提及AFP-L3%的推荐截断值。但是,荟萃分析[23]显示,AFP 截断值取400 ng/mL 时,总体敏感度仅32%。所以,AFP 截断值取400 ng/mL并不利于我国肝癌的早期筛查。
目前,关于AFP 和AFP-L3%在早期HCC 中截断值的研究大都基于BCLC 0期和A期,尚缺乏CNLC Ⅰa~Ⅱa期的研究。李贲等[24]以2011年版《原发性肝癌诊疗指南》为诊断标准,以符合米兰标准的肝移植标准定义为早期HCC,即单发肿瘤≤5 cm 或多发肿瘤≤3 个且最大直径≤3 cm,以AFP>20 ng/mL 及AFP-L3%>10%为截断值,得出AFP>20 ng/mL 及AFP-L3%>10%的敏感度、特异度分别为67.1%、62.3%和72.6%、83.1%。与前述文献[19,21]报道结果相近。本研究发现,在HBV相关CNLC 早期HCC 中,使用传统的化学发光免疫分析法检测AFP-L3,AFP和AFP-L3%的最佳截断值分别为8.7%和5%,敏感度分别为66.9%和58.1%,特异度分别为85.1%、88.4%;与单独AFP 或AFP-L3%相比,联合诊断的敏感度、阴性预测值、Kappa 值均最高,敏感度可提升至67.7%,并保留有84.7%的特异度,但AFP 单用对比AFP+AFP-L3%的AUC 无差异,可见,在HBV 相关CNLC 早期HCC 中,AFP 具有较好的诊断价值;对比前述文献[21]报道的其他病因所致肝癌,AFPL3%诊断HBV 相关早期HCC 的敏感度较高。此外,本研究对比了既往学者推荐的部分截断值[8,22,25-26],结果显示,与AFP 截断值分别取20、200、400 ng/mL 及AFP-L3%截断值分别取10%和15%的单独及两两联合相比,AFP 和AFP-L3%截断值分别为8.7 ng/mL 和5%时,单独或者联合检测诊断CNLC早期HCC的敏感度、阴性预测值、Kappa值均最高。因此,笔者认为,目前核苷类抗病毒药物的广泛使用已大大削减了AFP水平升高受肝脏炎症活动方面的影响,目前推荐的AFP和AFP-L3%截断值尚不能获得令人满意的早期HCC筛查效果,应下调其在HBV相关肝癌高危人群中的截断值,特别当AFP和AFP-L3%水平分别大于8.7 ng/mL和5%时,应加强监测,必要时完善诊断性影像学检查。与既往研究[27-28]结果一致,笔者发现,相对单独的AFP或AFP-L3%,二者联合诊断总体HCC敏感度最高。
众所周知,AFP 升高与肝脏活动性炎症相关。为排除AFP 由于受到ALT 升高的影响而造成的假性升高,本研究纳入了ALT 正常的CHB 和HBV 相关LC 患者为对照组,探讨ALT 正常HCC 的AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平,发现ALT 升高HCC 组的AFP 水平显著高于ALT 正常HCC 组,而两组的AFP-L3 和AFPL3%水平无明显差异,这与既往研究[18]相似,证实了AFP 与肝脏炎症活动相关,而AFP-L3 不受肝脏炎症活动的影响。因此,针对不同的ALT 水平,应该采用不同的AFP 和AFP-L3%截断值,AFP 升高同时伴有ALT升高时,应更重视AFP-L3%的参考价值。
本研究表明,AFP 在HBV 相关早期HCC 的最佳截断值为8.7 ng/mL,AFP-L3%为5%;在肝癌高危人群,AFP>8.7 ng/mL时应警惕肝癌的发生,需进一步排查早期HCC。对于伴有肝脏炎症活动的患者,AFPL3%升高亦需注意肝癌的发生。为了早期诊断HCC,有必要下调AFP和AFP-L3%诊断HCC的阈值。
本研究存在一定局限性,首先,本研究是单中心回顾性研究,未来需要开展多中心的前瞻性研究以证明AFP、AFP-L3%在CNLC 早期HCC 中的诊断意义及最佳截断值;其次,本研究中基线资料存在一定差异,还需进一步扩大样本量或者使用倾向性评分匹配等方法提高试验组与对照组之间的可比性;最后,本研究使用传统的化学发光免疫分析法检测AFP-L3,当AFP 浓度过低时无法得到精确的检测结果,可能会影响AFP-L3%的诊断效能评估,若使用高灵敏度的毛细管电泳芯片法或许可以更准确评估AFP-L3%的诊断效能。此外,临床上也需要结合其他筛查手段及影响因素以寻找性价比更高的肝癌早期筛查模式。
伦理学声明:本研究方案于2023 年1 月11 日经由中山大学附属第三医院伦理委员会审批,批号:Ⅱ2022-008-01。所有患者均知情同意。
利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:唐宇雁负责课题设计,收集数据,资料分析,撰写论文;谢仕斌负责课题设计,修改论文;朱建芸负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿。