女贞子-黄芪治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的网络药理学机制*

陈海群,华其荣,林 军,周青鸟,陈 嘉,覃 菲,王 璐,吴群英**

(1.桂林医学院药学院,广西桂林 541004;2.桂林医学院智能医学与生物技术学院,广西桂林 541004;3.广西医科大学基础医学院,广西南宁 530021)

前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是全球男性第二常见的恶性肿瘤,也是男性因癌症死亡的主要原因[1]。近年来,我国前列腺癌发病率明显增加,是男性泌尿系统中发病率增长最快的恶性肿瘤[2]。雄激素剥夺疗法(Androgen Deprivation Therapy,ADT)是治疗晚期PCa患者的基本方法,但研究证实几乎所有的PCa患者都会对雄激素阻断产生耐药性,发展为去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPC)[3],发生转移的CRPC(Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer,mCRPC)患者的中位生存期仅为 16-24 个月[4],目前尚无有效治疗mCRPC的药物[5]。现有用于治疗mCRPC的药物主要为雄激素受体靶向药物,如阿比特龙及恩杂鲁胺,但约20%的mCRPC患者会出现原发性耐药,导致治疗缓解期短[6],因此亟需研发治疗mCRPC的新兴药物。

中医药能够改善中晚期肿瘤患者的临床症状,稳定肿瘤病灶及提高患者生存质量[7]。有研究表明,中医药在治疗PCa及改善患者生存质量方面具有独特的优势[8]。据报道,女贞子(Ligustrumlucidum)-黄芪(Astragalusmembranaceus)在乳腺癌保乳术后调强放射治疗及胃癌辅助治疗中起重要作用,可以明显改善患者的生活质量,降低放疗与化疗的毒副作用,提高患者生存率[9,10]。但女贞子-黄芪是否可以作为治疗mCRPC的潜在药物,目前尚无相关研究报道。本研究拟利用网络药理学方法,对女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点与潜在机制进行探讨,为mCRPC药物研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 活性成分及作用靶点筛选

基于中药系统药理学 (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP) 数据库与分析平台,以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和类药性(Drug-Like,DL)≥0.18为标准[11],筛选女贞子-黄芪的活性成分及作用靶点。

1.2 mCRPC相关的差异表达基因分析

从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载芯片数据集GSE77930表达谱数据及相应的临床信息,该芯片数据集包含171个样本,其中CRPC样本22个,mCRPC样本149个。利用limma包对数据进行分析,以差异倍数的绝对值(|Fold Change,FC|)≥1.5倍,且P<0.05为标准[12],筛选mCRPC与CRPC之间差异表达的基因,并绘制热图及火山图。

1.3 女贞子-黄芪活性成分-药物靶点网络的构建

对筛选得到的女贞子-黄芪作用靶点和mCRPC相关的差异表达基因取交集,获得女贞子-黄芪治疗mCRPC的潜在作用靶点,利用Cytoscape 3.8.0软件构建女贞子-黄芪活性成分-mCRPC作用靶点网络。利用Cytoscape 3.8.0软件中Bisogenet和CytoNCA插件,选取HRPD、BIND、DIP、BIOGRID、INTACT和MINT 6个数据库,构建女贞子-黄芪活性成分与mCRPC靶点的蛋白质-蛋白质相互作用 (Protein-Protein Interaction,PPI) 网络。以度中心性(Degree Centrality,DC)>61,介数中心性(Betweenness Centrality,BC)>600为标准[13],筛选核心网络。

1.4 核心靶点GO富集分析

将筛选得到的交集靶点导入clusterProfiler包,进行GO富集分析,包括分子功能(Molecular Function,MF)、生物过程(Biological Process,BP)和细胞组分(Cellular Component,CC)3个方面[14]。

1.5 KEGG分析及靶点-通路网络构建

使用R语言,根据基因富集的数量和显著性,将富集得到信号通路结果导入Cytoscape 3.8.0软件,根据度值(Degree)的大小进行排序,显示前20条通路。利用Perl 5.30.0和Cytoscape 3.8.0构建靶点-通路网络[15],进一步分析女贞子-黄芪治疗mCRPC的核心靶点与信号通路。

2 结果与分析

2.1 女贞子-黄芪的活性成分及作用靶点

在TCMSP数据库与分析平台中,依据OB≥30% 和DL≥0.18筛选女贞子和黄芪的活性成分及作用靶点,获得女贞子的活性成分13个、黄芪的活性成分20个,包括槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、异鼠李素(Isorhamnetin)、芒柄花黄素(Formononetin)、圣草酚(Eriodictyol)和女贞果苷D (Lucidumoside D)等,其中山奈酚和槲皮素是女贞子和黄芪两种中药共有的活性成分(表1)。女贞子作用靶点1 025个,黄芪作用靶点968个。

2.2 mCRPC相关的差异表达基因

与未发生转移的CRPC相比,在mCRPC患者中差异表达的基因一共有1 067个,其中表达上调的基因424个,表达下调的基因643个(图1)。

表1 女贞子-黄芪活性成分

图1 mCRPC相关的差异表达基因

2.3 女贞子-黄芪活性成分-mCRPC作用靶点网络

按不同靶点对应有效成分的数目分类展示,共获得女贞子-黄芪治疗mCRPC的潜在作用靶点18个(图2)。对应的女贞子-黄芪有效成分11个(图 3,其中绿色表示女贞子的有效成分,黄色表示黄芪的有效成分,红色为女贞子-黄芪两者共有的有效成分,蓝色表示靶点基因),槲皮素的作用靶点最多,为15个;β-谷甾醇、圣草酚和女贞果苷D(苷元)的作用靶点最少,只有1个作用靶点。

图2 女贞子-黄芪治疗mCRPC的靶点韦恩图

图3 女贞子-黄芪的活性成分与关键作用靶点网络

2.4 女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点PPI网络

将女贞子-黄芪作用靶点与mCRPC相关的差异基因取交集后,利用Cytoscape 3.8.0中的Bisogenet插件绘制PPI网络图,得到一个由1 629个节点和40 875条边组成的网络(图4)。在此网络图的基础上,利用Bisogenet和CytoNCA插件,以DC>61作为初级筛选条件,获得一个由435个节点和17 187条边组成的网络[图5(a)中的黄色色块,即图5(b)]。将BC>600作为第二次筛选条件,最终得到一个由64个节点和941条边组成的核心网络[图5(b)中的黄色色块,即图5(c)],主要包括雄激素受体(Androgen Receptor,AR)、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和血管细胞黏附因子(Vascular Cell Adhesion Molecule 1,VCAM1)等关键靶点(图5中的红色色块)。

图5 PPI网络拓扑图

2.5 作用靶点GO富集分析

利用R语言对女贞子-黄芪治疗mCRPC的核心靶点进行GO富集分析,共得到GO条目82个。BP条目75个,主要参与酮体反应(Response to ketone)、对金属离子的反应(Response to metal ion)、伤口愈合(Wound healing)等生物学过程[图6(a)]。CC条目4个,主要富集在核染色体(Nuclear chromosome)、染色体区(Chromosomal region)、凝集的染色体(Condensed chromosome)和复制叉处(Replication fork)[图6(b)]。MF条目3个,涉及氧化还原酶活性(Oxidoreductase activity)和组蛋白激酶活性(Histone kinase activity)[图6(c)],提示女贞子-黄芪可能通过调节多种生物学过程发挥其治疗mCRPC的功效。

图6 核心靶点GO富集分析

2.6 KEGG信号通路与核心靶点互作网络

KEGG分析结果表明,女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点主要涉及乙型肝炎(Hepatitis B)、前列腺癌、细胞周期(Cell cycle)、Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)信号通路(VEGF signaling pathway)和细胞衰老(Cellular senescence)等通路(图7)。对获得的信号通路和作用靶点构建相互作用网络,结果发现,PRKCA、E2F1、E2F2和PPP3CA等核心靶点与多条信号通路密切相关,分别涉及了14、12、11及7个信号通路(图8),提示女贞子-黄芪可能通过多种有效成分作用于多个靶点,通过多个信号通路发挥其治疗mCRPC的作用。

图7 靶点的KEGG分析

图8 KEGG信号通路与核心靶点相互作用网络

3 讨论

网络药理学基于系统生物学和大数据分析,通过构建药物-靶点-疾病网络,探索药物发挥作用的机制,为中医药的现代化研究提供了新途径和新依据[16]。本研究将GEO芯片数据挖掘与网络药理学相结合,探讨女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点及潜在作用机制,结果发现女贞子-黄芪的有效成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素和芒柄花黄素等,其中槲皮素在拓扑网络中的度值较大,作用靶点最多。有研究报道,槲皮素在体外可抑制前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌、肺癌以及食管癌等多种肿瘤细胞的增殖与转移,诱导肿瘤细胞凋亡[17]。因此,槲皮素可能是女贞子-黄芪治疗mCRPC的核心成分。

通过构建蛋白互作拓扑网络图,可知女贞子-黄芪治疗mCRPC的18个潜在作用靶点中 ,在PPI网络发挥关键调控作用的靶点为AR、PCNA和VCAM1。Qiu等[18]研究证实,AR在PCa的发展、进展和转移中起着重要作用。PCNA是细胞增殖的标志物,其表达上调与肿瘤细胞的恶性增殖密切相关[19]。Juríková等[20]研究报道,PCNA高表达增加乳腺癌细胞的迁移和侵袭的危险性。Huang等[21]发现,VCAM1高表达与高级别浆液性卵巢癌的发生和预后不良密切相关。Ding等[22]发现VCAM1与肿瘤血管生成密切相关,胃癌中 VCAM1阳性组织的微血管密度高于 VCAM1阴性组织。Zhang等[23]报道,VCAM1高表达促进结直肠癌细胞的侵袭和转移。上述研究结果证实,AR、PCNA、VCAM1与肿瘤的发生、进展密切相关,表明女贞子-黄芪可能通过靶向mCRPC关键基因发挥治疗作用。

对女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点进行KEGG分析发现,作用靶点主要富集在乙型肝炎、前列腺癌、细胞周期、VEGF信号通路和细胞衰老等通路。Krystyna等[24]研究报道,有肝炎的男性患前列腺癌风险显著增加。Sarkar等[25]发现,乙型肝炎病毒感染与前列腺癌的发展有密切的关系,乙型肝炎病毒能促进AR信号传递。闫浩等[26]发现,前列腺癌信号通路激活能够促进AR靶基因的转录,促进细胞的增殖和转移。Ghafouri-Fard等[27]认为,槲皮素通过调节p21 CDK抑制剂和抑制pRb磷酸化,抑制细胞增殖。另外,槲皮素可通过靶向VEGFR-2 介导的血管生成途径,抑制下游调节因子AKT的表达,从而抑制肿瘤生长[28,29]。这些研究提示女贞子-黄芪可能通过调控以上信号通路发挥其治疗mCRPC的作用,表明女贞子-黄芪在治疗mCRPC方面极具潜力,但结果仍需进一步的实验验证。

4 结论

槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素和芒柄花黄素等成分可能是女贞子-黄芪治疗mCRPC的重要药效物质。女贞子-黄芪可能通过影响与mCRPC相关的多个信号通路发挥其治疗mCRPC的作用。本研究利用GEO芯片数据挖掘与网络药理学相结合的方法系统探讨女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用机制,为临床应用提供了一定的依据,但本研究中只纳入一个mCRPC数据集进行分析,研究结果还有待进一步证实。