血浆ctDNA 与弥漫大B 细胞淋巴瘤免疫亚型及预后相关性

刘京伟 许风霞 周倩

弥漫大B 细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin's lymphoma，NHL）亚型，约占NHL 的30%～40%［1-2］。DLBCL 具有明显的异型性及侵袭性，近年来，随着利妥昔单抗的广泛应用，患者生存期有所提高，但仍有部分患者治疗后复发，预后较差［3］。因此，识别高危患者，实施个体化治疗成为DLBCL 研究热点。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是循环游离DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）的一部分，由肿瘤细胞直接分泌，具有精确分子监测效能［4］。目前，ctDNA 已被证明可用于肝癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌等多种肿瘤诊断、预后评估和复发监测，具有作为生物标志物的潜在作用［5-6］。本研究尝试探讨DLBCL 患者血浆ctDNA 表达与免疫亚型及预后的相关性。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年4 月至2021 年4 月山东省临沂市中心医院94 例DLBCL 患者为研究对象，均符合DLBCL 诊断标准［7］，并经组织病理和免疫组化确诊；均采用标准R-CHOP 方案免疫化学治疗；患者及家属知情同意。其中男58 例，女36 例，年龄平均（58.93±7.82）岁。本研究经院伦理委员会批准。

1.2 方法

①临床资料收集：记录入组患者性别、年龄、B 症状、美国东部协作肿瘤组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）体能状况（performance status，PS）评分、国际预后指数（International Prognostic Index，IPI）评分、有无大包块、疾病分期、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）水平、B细胞淋巴瘤-2（B cell lympho-ma/leukemia 2 gene，Bcl-2）/核内原癌基因（nuclear oncogene，MYC）双表达、免疫亚型。②血浆ctDNA 检测：化疗前采集外周血10 mL，24 h 内离心，分离血浆。提取血浆游离DNA（德国Qiagen 公司QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit），进行质量评价（美国Thermo公司Invitrogen Qubit kit 试剂盒及荧光计）。捕获免疫球蛋白重链（IgH）目标基因组区域（美国InvivoScribe 公 司LymphoTrack IGH assay kit），扩增。构建DNA 文库，加入MiSeq Reagent Kit V2（美国Illumina 公司）试剂盘中，进行二代测序（Illumina 测序仪，美国Illumina 公司）。导出FASTQ 文件，分析数据（LymphoTrack 软件）。克隆序列频率＞5%为单克隆性重排序列［8］。③免疫亚型：采用免疫组化法检测MUM-1（北京中杉金桥公司鼠抗人MUM-1 单克隆抗体）、Bcl-6（北京中杉金桥公司鼠抗人Bcl-6 单克隆抗体）、CD10（福州迈新生物技术有限公司鼠抗人CD10 单克隆抗体），Bcl-6、CD10 在细胞核表达，CD10 在细胞膜表达，CD10 阳性为生发中心B 细胞样（Germinal center B-cell-lik，GCB）；Bcl-6、CD10 均阴性为非GCB；若CD10 阴性，Bcl-6 阳性，用MUM1 来分类，MUM1阴性为GCB，MUM1 阳性为非GCB［9］。

1.3 统计学处理

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计数资料用n（%）表示，χ2检验，等级资料采用Ridit 检验；预后影响因素采用COX 回归分析；使用相对超危险度比（RERI）、归因比（AP）、交互作用指数（SI）分析ctDNA、免疫亚型评估DLBCL 患者预后的交互作用。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL 患者血浆ctDNA 表达

94 例DLBCL 患者中，78 例ctDNA 检测呈阳性，16例ctDNA 检测呈阴性，阳性率达82.98%（78/94）。

2.2 DLBCL 患者血浆ctDNA 表达与病理特征的关系

IPI 评分高风险患者ctDNA 阳性表达率高于IPI 评分低风险患者，ⅡB～Ⅳ患者ctDNA 阳性表达率高于Ⅰ～ⅡA 患者，Bcl-2/MYC 双表达患者ctDNA 阳性表达率高于无Bcl-2/MYC 双表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 DLBCL 患者血浆ctDNA 表达与病理特征的关系［n（%）］Table 1 Relationship between plasma ctDNA expression and pathological features in DLBCL patients［n（%）］

2.3 DLBCL患者血浆ctDNA表达与免疫亚型的关系

94 例DLBCL 患者中，GCB 31 例，非GCB 63例。GCB 患者中ctDNA 阳性22 例，阳性表达率70.97%（22/31）；非GCB 患者中ctDNA 阳性56 例，阳性表达率88.89%（56/63）。非GCB 患者ctDNA阳性表达率高于GCB 患者，差异有统计学意义（χ2=4.724，P=0.030）。免疫组化图。见图1。

2.4 DLBCL 患者预后单因素分析

治疗后随访1 年，生存78 例，死亡16 例。单因素分析显示，性别、年龄、B 症状、ECOG PS 评分、IPI 评分、有无大包块与DLBCL 患者预后无关（P＞0.05），疾病分期、LDH 水平、Bcl-2/MYC 双表达、免疫亚型、ctDNA 阳性率对DLBCL 患者预后有关（P＜0.05）。见表2。

表2 DLBCL 患者预后单因素分析［n（%）］Table 2 Univariate analysis of prognosis in DLBCL patients［n（%）］

2.5 DLBCL 患者预后多因素COX 回归分析

以预后情况为因变量（赋值：生存=0，死亡=1），将表2 中差异有统计学意义的项作为自变量（赋值：疾病分期：Ⅰ～ⅡA=1，ⅡB～Ⅳ=2；LDH 水平：正常=1，升高=2；Bcl-2/MYC 双表达：无=0，有=1；免疫亚型：GCB=1，非GCB=2；ctDNA：阴性=0，阳性=1），应用COX 回归模型分析，结果显示，免疫亚型为非GCB 型、ctDNA 阳性均为DLBCL患者死亡的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 DLBCL 患者预后多因素COX 回归分析Table 3 COX regression analysis of multivariate prognostic factors in DLBCL patients

2.6 ctDNA、免疫亚型评估DLBCL 患者预后的交互作用

ctDNA 阳性为（+），阴性为（-），免疫亚型非GCB 型为（+），GCB 型为（-）。调整混杂因素后，ctDNA、免疫亚型对DLBCL 患者不良预后存在正向交互作用，二者均为（+）时不良预后是二者均为（-）时的49.500 倍，是其他未知因子（OR=1）的34.140 倍（RERI=34.140），协同效应为二者单独存在产生效应之和的3.390 倍（SI=3.390），在二者共存的不良预后风险中有68.97%（AP=68.97%）是由两者协同作用引起的。见表4。

表4 ctDNA、免疫亚型评估DLBCL 患者预后的交互作用Table 4 Interaction of ctDNA and immune subtypes in evaluating prognosis of DLBCL patients

3 讨论

ctDNA 占总cfDNA＜1%，但易扩增，随着二代测序（Next generation sequencing，NGS）技术的临床应用，其检测灵敏度显著提高，已成为肿瘤研究领域热点［10］。DLBCL 是B 淋巴细胞恶性克隆性增生所致，而B 淋巴细胞分化成熟过程中，其IgH受体基因片段过基因重排形成特异可变性（V）多样性（D）连接（J）序列。基于此原理，IgH VDJ 序列检测可对B 淋巴细胞克隆性评估提供指导，并可作为DLBCL 分子标记物。利用VDJ 通用引物将NGS 与VDJ 基因片段扩增相结合，在DLBCL 患者血浆中进行ctDNA 检测，灵敏度可达到1×10-6［11］。本研究采用上述特异性的捕获测序法进行IgH 受体基因VDJ 重排的ctDNA 检测，阳性率达82.98%（78/94），与王佳萍等［12］研究一致。分析DLBCL 患者血浆ctDNA 表达与病理特征的关系，发现IPI 评分高风险患者ctDNA 阳性表达率高于IPI 评分低风险患者，ⅡB～Ⅳ患者ctDNA 阳性表达率高于Ⅰ～ⅡA 患者，Bcl-2/MYC 双表达患者ctDNA 阳性表达率高于无Bcl-2/MYC 双表达患者，提示ctDNA 可一定程度反映患者肿瘤负荷。而王佳萍等［12］研究却显示，DLBCL 患者血浆ctDNA 表达与IPI 评分、疾病分期无关。差异原因可能与选取样本量及患者个体差异有关。上述结果表明，IgH VDJ 重排的ctDNA 检测阳性率较高，有助于DLBCL 早期辅助诊断，且可一定程度反映肿瘤负荷。

肿瘤分子生物学能够更准确地指导DLBCL治疗和预后判断。本研究结果提示DLBCL 患者血浆ctDNA 表达可能与免疫亚型存在一定相关性。非GCB 型DLBCL 特点在于，多始发于淋巴结外组织，易发生结外浸润，B 症状者占73.3%，Ⅲ、Ⅳ期患者占80.0%；而GCB 型结外浸润较少，多无B 症状，以Ⅰ、Ⅱ期多见［13］。因此，非GCB 型DLBCL 侵袭性高于GCB 型，这可能是ctDNA 高表达的重要因素。

COX 回归模型分析结果提示DLBCL 患者免疫亚型、ctDNA 表达对预后具有一定预测价值，非GCB 型DLBCL 侵袭性更高，预后更差，与既往研究［14］一致。研究证实，IgH 基因重排可作为复发监测的生物标志物，特异度在98%以上［15］；而在临床提示复发前，存在IgH 基因重排者占比存在较大差 异［16］。Roschewski 等［17］对108 例DLBCL患者治疗2 个周期时IgH 基因重排进行检测，发现IgH 基因重排可提示早期复发，特异度为88%，灵敏度为47%。这些结果也提示ctDNA 可作为DLBCL 患者预后预测的生物标志物，支持本研究结论。另外，交互作用分析可知，ctDNA、免疫亚型对DLBCL 患者不良预后存在正向交互作用。因此，免疫亚型为非GCB 型的DLBCL 患者更应注重ctDNA 检测，从而为早期干预提供指导。目前，ctDNA 检测在DLBCL 中应用价值已被初步验证，但检测过程较复杂，尚无统一检测标准及质控，且成本高，尚无法在临床广泛应用。

综上可知，DLBCL 患者ctDNA 检测阳性率较高，且与病理特征、免疫亚型及预后有关，有望成为病情进展及预后预测标志物。