基于网络药理学与分子对接探讨小儿豉翘清热颗粒治疗甲型流感的作用机制

刘娇，周蓓，易蔚，陈明惠

广西中医药大学，广西 南宁 530200

从过去的100 年至今，全世界暴发了多次全球性的流感大流行[1]。全人群对流感普遍易感，而儿童在流感季节是重点关注群体[2]，在每年流行季节儿童罹患率为20%～30%，特定地区的儿童流感罹患率可达到50%左右[3]。甲型流感是春季易流行的常见流感病毒，且甲型流感病毒易变异，流感疫苗预防接种不能有效预防变异毒株的感染[4]，西医针对甲型流感常用神经氨酸酶抑制剂奥司他韦作为首选用药[5]，但存在甲型流感病毒耐药的风险，小儿豉翘清热颗粒治疗儿童甲型流感有显著效果[6]，且在流行性感冒诊疗方案、儿童流感中西医结合等专家共识中作为推荐用药[7-8]。临床报道发现联用小儿豉翘清热颗粒比单用奥司他韦在使症状改善、加快病毒转阴等方面，具有明显疗效[9]。网络药理学是基于疾病-靶点-药物的多层网络结构，从系统角度预测药物靶点，实现了传统药物与现代科学的接轨，是中医药领域的研究热点[10-11]。使中医现代化具有潜在的发展前景。分子对接是研究配体和受体相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[12]，为新型药物的研发提供了一个较好的工具[13]。因此，本研究借助网络药理学和分子对接技术，分析小儿豉翘清热颗粒治疗甲型流感的作用机制，为后续研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 数据库信息

UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）；中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库（https://old.tcmspe.com/tcmsp.php）；GeneCars 数据库（https://www.genecards.org）；OMIM 数据库（https://omim.org）；TTD 数据库（https://db.idrblab.net/ttd）；PharmGkb 数据库（https://www.pharmgkb.org）；STRING 数据库（https://cn.string-db.org）；DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov）；微生信官网（https://www.bioinformatics.com.cn）。

1.2 筛选药物及疾病靶点

小儿豉翘清热颗粒药物组成有连翘、淡豆豉、薄荷、荆芥、炒栀子、大黄、青蒿、赤芍、槟榔、厚朴、黄芩、半夏、柴胡、甘草，运用中草药系统药理学平台TCMSP 数据库筛选药物活性成分，筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18[14]。利用UniProt蛋白质数据库查询药物靶点对应的基因名。以“H1N1 influenza A virus”“H1N1”“human influenza A virus”“influenza A”为关键词检索疾病靶点，借助GeneCards、OMIM、TTD 及PharmGkb 数据库筛选疾病靶点，GeneCards 靶点筛选条件Relevance score≥5，将获取疾病靶点取并集。

1.3 构建“药物-活性成分-靶点”网络图

将筛选出的药物活性成分及靶点导入Cytoscape 3.9.1 软件进行网络可视化，构建“药物-活性成分-靶点”网络图。

1.4 构建蛋白互作（PPI）网络图

将药物靶点与疾病靶点取交集作为治疗儿童甲型流感的潜在治疗靶点，将交集靶点导入STRING数据库，预测基因靶点之间相互关联，设置“organisms”为“HomoSapiens”，最低互作阈值设置为0.400，将预测结果PPI网络图数据导入Cytoscape 3.9.1 软件中可视化。

1.5 基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析

将交集基因导入DAVID 生物信息数据库中，“SelectIdentifier”选择为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物种选择为“Homo_sapiens”，进行GO富集分析和KEGG 富集分析，得到生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）及KEGG 通路分析数据，将数据结果运用微生信在线平台绘制出GO 富集和KEGG 通路可视化图。

1.6 分子对接

借助Cytoscape 3.9.1 软件中“药物-活性成分-靶点”网络图数据信息，将交集靶点导入Cytoscape 3.9.1 软件中，取与交集靶点相连的网络成分，新建交集靶点网络可视化图，根据degree 大小排序得到排名靠前的小分子配体。借助PPI 网络图，根据degree 排名，得到排名靠前的大分子受体。利用PubChem 下载小分子配体 3D 结构，并运用OpenBabelGUI 软件进行格式转化mol2 结构；通过UniProt 数据库及PDB 数据库结合分析找到大分子受体的蛋白结构，利用PyMol 软件对大分子蛋白去配体、去水分子等处理，并运用AutoDockTool 软件对结构进行加氢、活性口袋等处理，借助Autodockgrid 及Autodocktool 计算结合能，最后运用PyMol 软件进行结果可视化。

2 结果

2.1 有效活性成分筛选

通过TCMSP 数据库筛选出小儿豉翘清热颗粒共有245 种药物活性成分，获取药物活性成分信息，根据OB 排序，前30 个化学成分见表1，借助UniProt进行靶点规范化，得到269 个药物靶点。

表1 小儿豉翘清热颗粒活性化合物Table 1 Active components in Xiaoer Chiqiao Qingre Granules

2.2 疾病靶点筛选

通过GeneCards、OMIM、TTD 及PharmGkb 数据库共同筛选疾病靶点，其中在GeneCards 数据库中筛选出1 545 个甲型流感相关基因，OMIM 数据库中筛选出520 个甲型流感相关基因，TTD 筛选出3 个甲型流感相关基因，PharmGkb 数据库筛选出9个相关甲型流感基因，取并集，得到2 045 个疾病靶点。将药物基因与疾病基因取交集，借助Venny 2.1 绘制韦恩图，共获得131 个交集靶点，见图1。

图1 药物-疾病靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of drug-disease target

2.3 “药物-成分-靶点”网络构建

将TCMSP、UniProt 数据库获得的相关药物活性成分及靶点基因数据信息，通过Cytoscape 3.9.1构建“药物-活性成分-靶点”网络图，见图2。通过网络分析共获得484 个节点和4 474 条边。根据“药物-成分-靶点”网络图，将药物所有小分子的节点大小用“degree”表示，得到活性小分子得分排序为：槲皮素（731）、豆甾醇（239）、山柰酚（229）、β-谷甾醇（224）、木犀草素（166）、黄芩素（131）、汉黄芩素（82）、柚皮素（70）。这些小分子可能是小儿豉翘清热颗粒的关键活性成分。

图2 药物-成分-靶点网络图Fig.2 Network diagram of drug-component-target

2.4 PPI 网络图构建

将交集基因导入STRING 蛋白互作分析数据库中，物种选择为人类，基因靶点之间相互作用关系以PPI 网络图呈现，将STRING 数据库运算出的PPI网络数据导入Cytoscape 3.9.1 可视化，见图3。其中，形状越大、颜色越深代表相互关联作用最强。通过Cytoscape 3.9.1 软件cytoNCA 插件对PPI 网络图进行核心靶点筛选，通过degree 值排序，得出前10 位的核心靶点，见表2。

图3 蛋白互作网络图Fig.3 Protein-protein interaction networks

表2 核心靶点信息分析Table 2 Analysis of core target information

2.5 GO 富集分析和KEGG 信号通路分析

通过DAVID 数据库分析得出910 条GO 富集条目及174 条KEGG 信号通路，其中，GO 功能富集结果包括BP 704 个，CC 72 个，MF 134 个。选取GO 富集分析中每组前10 位绘制条形图，见图4。由图可知，BP 主要与细胞凋亡过程、炎症应答、细胞凋亡过程的正负调控、对药物的反应等相关，CC 主要与膜筏、胞外区、线粒体、细胞质等相关。MF 主要与酶结合、蛋白结合、细胞因子活性、转录因子结合等相关。

图4 GO 富集分析条形图Fig.4 Bar chart of GO enrichment analysis

KEGG 信号通路分析收集排名前20 位的信号通路绘制气泡图，见图5，颜色越深气泡越大，说明富集程度越大。由图可知，KEGG 信号通路主要与TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、IL-17 信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE、C 型凝集素受体信号通路等通路密切相关。

图5 KEGG 信号通路气泡图Fig.5 Bubble diagram of KEGG signaling pathway

2.6 分子对接

新建交集基因可视化网络图按照degree 排名前8位小分子配体分别是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素、汉黄芩素、柚皮素。根据蛋白互作网络图筛选degree 排名前10 的核心靶点是蛋白激酶B1（AKT1）、肿瘤坏死因子（TNF）、TP53、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1B、血管内皮生长因子A（VEGFA）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、胱天蛋白酶3（CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、基质金属蛋白酶9（MMP9）。将小分子配体和核心靶点受体进行分子对接，结合能显示出有良好的结合性，绘制分子对接结合能柱状见图6。利用PyMol 将蛋白受体与分子配体进行分子对接，见图7。

图6 分子对接结合能柱状图Fig.6 Bar chart of molecular docking binding energy

图7 分子对接图Fig.7 Molecular docking diagram

3 讨论

春季风正木时，气候温暖多风，阳气上升，清代叶天士在《温热论》曰：“春月受风，其气已暖”。甲型流感感染后以发热、头痛、肌痛和全身不适起病，体温可达39～40 ℃[1]，具有极强的传染性，能够引起大范围流传的外感热病，符合“时行感冒、温病、瘟疫”范畴[15]。初期常辨证为邪犯肺胃证，具有疏风解表、清热导滞等功用。小儿豉翘清热颗粒是由连翘、淡豆豉、薄荷、荆芥、炒栀子、大黄、青蒿、赤芍、槟榔、厚朴、黄芩、半夏、柴胡、甘草14 味中药组成，源于儿科名家李少川教授50 余年行医经验，在银翘散和达原饮基础上化裁而成[16]，选取吴鞠通《温病条辨》中的“辛凉平剂”银翘散，主治温病初起，邪在卫分；达原饮源自《瘟疫论》，用于瘟疫初起，邪伏膜原。在温病初起阶段疏散风热、辟秽化浊，同时兼顾小儿肺脾不足的特点，达到疏风解表、清热导滞的作用。

本研究确定了小儿豉翘清热颗粒的主要成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素、汉黄芩素、柚皮素。并获取了治疗甲型流感的关键作用靶点AKT1、TNF、TP53、IL-6、IL-1B、VEGFA、STAT3、CASP3。KEGG 通路主要与Toll样受体信号通路作为主要通路之一。

3.1 抗炎作用

Toll 受体信号通路（TLRs）是小儿豉翘清热颗粒作用在甲型流感病毒主要通路之一，TLRs 是先天性免疫的始动环节，存在非特异免疫细胞及某些体细胞表面的识别受体，通过调控下游髓分化因子88（MyD88）转导途径募集下游白介素1 受体关联激酶1（IRAK1）和IRAK2，使IRAK磷酸化脱离MyD88并与肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）结合，从而激活IκB 激酶（IKK 复合体）并导致NF-κB 信号通路激活，使TNF、IL-6 及IL1B 炎症细胞因子表达，从而调节病毒感染引起的炎症反应。相关研究证实，小儿豉翘清热颗粒的主要成分中山柰酚、β-谷甾醇及汉黄芩素抵抗甲型流感发挥抗病毒作用可能与TLRs 下游NF-κB 信号通路发生联系[17-19]，且槲皮素和豆甾醇都直接或间接发挥抗炎作用[20-21]。

3.2 抗病毒作用

木犀草素和黄芩素可通过抑制病毒蛋白的合成从而达到抗病毒作用，Yan 等[22]发现木犀草素通过抑制病毒外壳蛋白Ⅰ复合物的表达，而黄芩素则是通过抑制甲型H5N1 流感病毒的NP 蛋白的产生[23]；TP53 和STAT3 是甲型流感病毒作用靶点，TP53 通过转录调控hGBP1 的表达发挥抗病毒效应[24]，流感病毒诱导的宿主细胞STAT3 分子早期活化被RIG-I/MAVS 信号通路调控而达到抗病毒作用[25]。

3.3 通便作用

小儿豉翘清热颗粒药物组成中槟榔、厚朴、大黄有下气导滞功用，《黄帝内经》提到肺与大肠相表里，与小儿豉翘清热颗粒具有疏风解表、清热导滞相契合，本项研究中槲皮素、山柰酚、木犀草素等具有通便效果，Liu 等[26]提出槲皮素可以通过增加Cajal 间质细胞标记物（c-Kit 和SCF）以及水通道蛋白3 的水平来缓解便秘；吴浩等[27]提出槲皮素、山柰酚、木犀草素可能通过调节M 受体及其下游信号通路PKC 蛋白的表达发挥润肠通便的作用。

3.4 细胞凋亡及气道水肿

AKT1 及CASP3 抑制流感病毒细胞凋亡的作用靶点。AKT1 是丝氨酸/苏氨酸激酶，它通过多种途径磷酸化促进细胞生长及抑制细胞凋亡作用[28]。相关研究表明通过抑制CASP3 的激活，使裂解的RARP、Caspase-8 和Bax 表达下调，从而抑制病毒感染诱导的细胞凋亡[29]。在减轻气道水肿方面：VEGFA 属于血管内皮生长因子（VEGF），相关研究提出炎症介质可以促进VEGF 与其受体的表达，VEGF 的升高可导致支气管血管的渗透性增加，引起肺间质内物质改变，造成气道水肿，增加气道感染风险[30-31]。

综上所述，本项研究从网络药理学和分子对接的角度出发，发现小儿豉翘清热颗粒治疗甲型流感通过多靶点、多通路、多效应发挥着作用，主要与炎症反应、病毒感染、细胞凋亡等相关，并预测可能与Toll 样受体信号通路相关，同时分子对接显示出活性关键分子与核心靶点受体对接有良好的结合性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突