乳化/破乳法-气相色谱串联质谱法测定牛奶中12 种亚硝胺残留

童文烽，李劲松，徐 巧，李 剑

（杭州谱育科技发展有限公司，浙江杭州 311305）

亚硝胺是一类具有高度致癌性和致突变性的挥发性污染物，基本结构单元为N-N=O[1]。常见的亚硝胺有N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基甲基乙胺（NMEA）、N-亚硝基二丁胺（NDBA）、N-亚硝基正丙胺（NDPA）、N-亚硝基吗啉（NMOR）、N-亚硝基哌啶（NPIP）、N-亚硝基二苯胺（NDPhA）和 N-亚硝基吡咯烷（NPYR）等。在目前已发现的300 多种亚硝胺化合物中，超过90%的亚硝胺均有动物致癌作用[2]，其中NDMA 和NDME已被国际癌症研究机构（IARC）定为2A 类致癌物[3]。大量动物试验表明，亚硝胺的暴露与食管癌、肝癌、胃癌以及心血管疾病的发生率呈正相关[4-8]。人体可通过内源性合成和外源直接摄入亚硝胺[9]，内源性合成可通过摄入含有亚硝酸盐的植源性和动物源性食品，亚硝酸盐在胃部酸性的环境下与蛋白质反应生成亚硝胺。

研究表明，食品中的蛋白质在内源酶和微生物作用下易生成胺类物质，可与食品中的亚硝酸盐反应生成亚硝胺类化合物[10]。亚硝酸盐通常作为防腐剂存在于肉制品和乳制品中[11]，并会进一步形成致癌的亚硝胺，对人体健康有害。目前针对亚硝胺的检测主要针对腌熏制品以及肉制品等，然而国内外针对牛奶中亚硝胺残留量的文献较少。牛奶中含有大量的碳水化合物、乳脂以及蛋白质，前处理净化对于准确测定牛奶中亚硝胺十分重要。研究表明，乳化/破乳法对于样品中疏水性强的提取物质（例如甘油三酯、萜类化合物、游离脂肪酸、甾醇等）有良好的净化效果，通过在有机提取液中加水乳化，使弱极性杂质形成许多微米级的液滴，再利用亲水滤膜对乳液进行破乳来达到净化的目的[12]。该法在油脂农残检测[12]、重金属回收[13]、药物分离[14]、染料去除[15-16]等领域都有较好的应用效果。亚硝胺的检测手段主要有气相色谱法[17-19]、液相色谱法[20-21]、气相色谱-串联质谱联用法[22-26]和液相色谱-串联质谱联用法[27-28]。气相或液相的方法相比于质谱法而言灵敏度偏低，对于复杂基质中的准确定量存在困难，且气相色谱-串联质谱法对于挥发性亚硝胺化合物有良好的灵敏度。鉴于此，本研究将乳化/破乳法应用于牛奶基质的前处理中，建立一种高效便捷、高灵敏度的气相色谱-串联质谱定量方法，用于准确测定牛奶中12 种亚硝胺的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

调制乳、巴氏杀菌乳、超高温杀菌乳 市售；12 种亚硝胺混合标准溶液，浓度均为200 µg/mL上海安谱实验科技股份有限公司；N-亚硝基二甲基胺-d6（1000 µg/mL）、N-亚硝基二丙胺-d14（100 µg/mL）、N-亚硝基二丁基胺-d18（100 µg/mL）上海安谱实验科技股份有限公司；丙酮、乙腈 均为色谱纯，德国Merck 公司；氯化钠、无水硫酸镁、柠檬酸钠、柠檬酸二钠 均为分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；聚四氟乙烯（PTFE）针式滤器、聚醚砜（PES）针式滤器、尼龙（PA）针式滤器，规格均为25 mm×0.22 µm 上海安谱实验科技股份有限公司。

GC 2000 气相色谱仪、EXPEC 5231 三重四极杆质谱仪、MassExpert 软件 杭州谱育科技发展有限公司；TGL-16M 冷冻离心机 湖南湘仪集团；BSA 224S-CW 万分之一天平 德国Sartorius 公司；230VEU PLUG 涡旋混匀器 美国Labnet 公司；Cascada I 超纯水仪 美国PALL 公司；KQ-800DE 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 分别吸取1.1 中N-亚硝基二甲基胺-d6 溶液10 μL，N-亚硝基二丙胺-d14 和N-亚硝基二丁基胺-d18 溶液各100 μL，乙腈定容至10 mL，得到浓度为1 μg/mL 的内标混合溶液。样品提取参考李登昆等[25]的研究，并进行调整，具体如下：称取5 g 牛奶样品于50 mL 离心管中，加入内标混合溶液（50 μL），加5 mL 乙腈，振摇1 min 后超声10 min，8000 r/min 离心5 min，取上清，重复提取一次后，合并上清液，加入3 g 无水硫酸镁，1 g 氯化钠，0.5 g 柠檬酸钠，0.25 g 柠檬酸二钠，涡旋15 min后，8000 r/min 离心5 min。

采用乳化/破乳操作对提取液进行净化，参考Wang 等[12]的研究并进行调整，具体如下：取出上述离心后的5 mL 清液，加入5 mL 水乳化，手动混匀后过PA 针式滤器进行破乳后，在滤液中加入4 g 无水硫酸镁，1 g 氯化钠，8000 r/min 离心5 min，取1 mL上清于进样瓶中，上机进样。

1.2.2 气相色谱条件 色谱柱：HP-INNOWAX 色谱柱（30 m⊆0.25 mm，0.25 µm）；载气：高纯氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，柱流量1.2 mL/min；隔垫吹扫流量：3.3 mL/min；载气吹扫流量：25 mL/min，于进样0.75 min 后打开；进样口温度：250 ℃；进样体积1 µL，不分流进样。柱升温程序：初始温度为50 ℃；以20 ℃/min 速率升温至190 ℃，保持1 min，最后以40 ℃/min 速率升温至250 ℃，保持5.5 min。

1.2.3 质谱条件 离子源采用电子轰击源（EI），离子源温度250 ℃，气质接口温度250 ℃，碰撞气为高纯氮气（纯度≥99.999%），溶剂延迟设置3 min，进行多反应监测模式（MRM）参数的采集与优化，各化合物的质谱参数如表1 所示。

1.2.4 标准曲线溶液配制 使用乙腈将亚硝胺混合标准溶液稀释成不同浓度的标准曲线工作液，并加入等量内标混合溶液，内标浓度为5 ng/mL，12 种亚硝胺的质量浓度范围均为1～100 ng/mL，混匀后装瓶进样，由气相色谱分离，质谱检测，以浓度为横坐标，以峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标进行线性拟合，得标准曲线。

1.2.5 方法应用 完成方法学验证后，应用该方法对购自当地超市的3 类牛乳样品进行测试，每份样品重复3 次。

1.3 数据处理

所有实验设置3 组平行，前处理优化结果表示为平均值±标准差（mean±SD），回收率结果表示为平均值，并计算其相对标准偏差（RSD）。数据通过Excel 进行计算并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 仪器与前处理条件

2.1.1 仪器条件的优化 参考前人研究，本实验选择HP-INNOWAX 毛细管色谱柱作为分析柱，并对升温程序进一步优化，在保证较好分离度的前提下，使色谱分离时间控制在15 min 内，相比于国标《GB 5009.26-2016 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》，分析时间缩短一半。同时对质谱参数进行了优化，将MRM 模式下的碰撞能量做了调整，确定了质谱条件。优化后的亚硝胺混合标准品的提取离子流图（EIC）如图1 所示。

图1 标准品的EIC 图Fig.1 Extracted ion chromatogram of the standard

2.1.2 滤膜的选择 分别采用PTFE，PES 以及PA滤膜对牛奶加标样品进行前处理，以化合物回收率进行评价其前处理效果。结果如图2 所示，相较其它2 种滤膜，PA 膜对于12 种化合物均有较好的回收率，均在80%～120%之间。而使用PTFE 膜进行破乳，NPYR 回收率偏高，大于120%；PES 则有6 个化合物回收率偏高，不符合国标《GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》中的要求（当被测组分含量＜0.1 mg/kg 时，回收率应控制在60%～120%之间），因此本研究选取PA 膜进行前处理破乳。

图2 不同滤膜对方法准确性的影响Fig.2 Effect of different filters on method accuracy

2.1.3 提取剂的选择 亚硝胺属强极性化合物，且牛奶中含有较多的蛋白质、乳脂肪以及碳水化合物等，选择合适的提取剂能有效提升亚硝胺化合物的提取效率，而且盐析效应有助于萃取效率的提升[29]。本实验考察了乙腈，丙酮以及乙腈/丙酮（80/20）提取剂对加标样品中亚硝胺的提取效果。从图3 可以看出，使用丙酮进行提取，有8 种亚硝胺化合物有较好的提取效果，但NMPhA 和NEPhA 提取效率不佳，回收率均低于50%，NYPR 和NDPhA 回收率高于150%；使用乙腈/丙酮（80/20）进行提取，NEPhA 提取效率仍旧不佳，且NPYR 回收率偏高。而使用乙腈进行提取，12 种亚硝胺回收率均能保持在80%～120%之间，效果良好。因此本研究选择乙腈作为最佳提取剂。

图3 提取剂对方法准确性的影响Fig.3 Effect of extractants on method accuracy

2.1.4 提取次数的优化 考察了不同提取次数对于提取效率的影响，分别对牛奶加标样品使用最佳提取剂提取1、2、3 次，以回收率比较不同提取次数下的提取效果，结果如图4 所示。可以看出，提取1 次的情况下，NDPA、NMPhA，NEPhA 和NPIP 提取效率不佳，回收率较差（低于70%）；而提取2 次和3 次，各化合物均有较好的提取效果，回收率较好，并无明显差异，故本研究选择提取次数为2 次作为最佳的提取次数。

图4 提取次数对方法准确性的影响Fig.4 Effect of extraction times on method accuracy

2.2 方法学验证结果

2.2.1 基质效应 为了验证牛奶基质对目标分析物的信号是否存在抑制或者增强作用，本研究通过比较溶剂标准品响应值和同浓度基质标准品响应值的比值来评估亚硝胺类化合物在牛奶中的基质效应（Matrix effects，ME），根据公式：ME（%）=（AM/AS-1）×100 计算[30]，其中，AM 是样品溶液中亚硝胺的响应值，AS 是标准溶液中亚硝胺的响应值。ME（%）的绝对值在0～20%之间，表明基质效应较弱，可以忽略；ME（%）大于20%，表明基质效应明显，影响样品分析准确性。结果如表2 显示，牛奶基质中12 种亚硝胺类化合物的ME（%）的绝对值均大于20%，表明目标化合物在牛奶中展现出较强的基质效应，使用内标法校准后，各化合物的基质效应均得到有效消除。因此，本研究采用内标法进行校正，减少了基质效应对亚硝胺类化合物的准确定量影响。

表2 亚硝胺在牛奶基质中的基质效应评价（n=3）Table 2 Evaluation of matrix effect of nitrosamines in milk(n=3)

2.2.2 线性与定量限 各化合物的线性以及灵敏度如表3 所示，其中NPYR 的线性范围为2～100 ng/mL，其余亚硝胺的线性范围均为1～100 ng/mL；12 种亚硝胺的决定系数R2均大于0.995，说明其在试验设定的浓度范围内线性良好。通过对混合标准品的逐步稀释进样，以信噪比S/N=10 为定量限（LOQ），其中NPYR 的定量限为4 µg/kg，其余化合物的定量限均为2 µg/kg，表明该方法的灵敏度较好，与同为气相色谱-串联质谱法测定亚硝胺的国标GB/T 29669-2013 相比，灵敏度更优。

表3 方法线性及灵敏度评价Table 3 Evaluation of method linearity and sensitivity

2.2.3 方法精密度与回收率 取牛奶样品，平行6 份，将已知量的亚硝胺混合标准溶液加入牛奶样品中，加标量为高、中、低3 个水平，经过同样的前处理步骤完成3 d、3 个浓度水平、6 个样品平行加标试验。计算测定值的RSD，得到日内精密度和日间精密度，并计算回收率，来评估方法的准确性。结果显示，各亚硝胺化合物的日内精密度范围在1.76%～7.62%之间，日间精密度范围在2.75%～7.71%之间（表4），且回收率为90.90%～114.30%，RSD 为2.54%～9.93%（表5），说明该方法具有良好的准确度与精密度，满足12 种亚硝胺的准确定量需求。

表4 日内及日间精密度结果Table 4 Results of intra-day and inter-day precision

表5 三水平加标回收试验结果Table 5 Results of three-level spiked recovery test

2.3 实际样品检测结果

选择3 类具有代表性的市售牛奶，分别为巴氏杀菌乳、调制乳以及超高温杀菌乳，每类各选择两个不同品牌进行定量检测。结果显示，3 类牛奶共6 份牛奶样品中均有NDPhA 检出，含量范围在4.29～6.67 μg/kg，其余亚硝胺未检出。样品图谱如图5所示。

图5 牛奶样品色谱图Fig.5 Chromatograms of milk samples

3 结论

本研究基于乳化-破乳法，利用气相色谱-串联质谱平台建立了牛奶中12 种亚硝胺的定量检测方法。该方法前处理步骤简单，能够在15 min 内完成12 种目标亚硝胺的分离与定量，各化合物的线性与稳定性良好，决定系数R2均大于0.995，日内精密度在1.76%～7.62%之间，日间精密度在2.75%～7.71%之间，且回收率为90.90%～114.30%，NPYR 的定量限为4.00 µg/kg，其余化合物的定量限均为2.00 µg/kg。方法的精密度与准确度良好，大大缩短了分析时间，可满足牛奶中12 种亚硝胺的准确定量。